内体MrGPRX1信号增强瞬时受体电位香草酸亚型1（TRPV1）敏感性以增强瘙痒

《Frontiers in Molecular Neuroscience》：Endosomal MrGPRX1 signaling sensitizes TRPV1 to enhance itch

　　

G蛋白偶联受体（GPCR）和瞬时受体电位香草酸亚型（TRPV）通道对于包括神经传递、疼痛和瘙痒在内的生理过程中的信号转导至关重要。GPCR信号的下游效应物可以直接刺激TRPV通道或增强其对刺激的敏感性，这一过程被称为TRPV敏化。传统上，GPCR在细胞表面被细胞外激动剂激活，从而触发信号级联反应。最近的证据表明，GPCR继续从细胞内细胞器发出信号。人类Mas相关G蛋白偶联受体X1（MrGPRX1）是一种在参与伤害感受和瘙痒的初级感觉神经元中表达的GPCR。最近的研究证明了细胞内GPCR信号如何调节神经元活动。然而，目前还没有表征MrGPRX1运输或细胞内信号的证据。在此，研究人员表征了MrGPRX1在内体网络内的信号及其在敏化TRPV1通道以增强瘙痒信号中的作用。利用亚细胞靶向生物传感器，研究人员证明MrGPRX1可以在内体中运输并发出信号。免疫荧光分析显示，MrGPRX1在牛肾上腺髓质（BAM）8–22刺激后内化。生物发光共振能量转移（BRET）测定显示，MrGPRX1激活诱导Gαq和β-抑制蛋白-1（β-arrestin-1）募集到质膜和早期内体。发动蛋白（dynamin）或网格蛋白（clathrin）的抑制阻断了BAM8-22诱导的MrGPRX1内吞作用，并减少了核细胞外信号调节激酶（ERK）信号传导。钙信号传导证实，MrGPRX1介导的TRPV1敏化是由蛋白激酶C（PKC）和ERK激活介导的。研究人员的发现揭示了MrGPRX1内体信号在TRPV1敏化中的新作用。了解MrGPRX1信号的机制为区分疼痛和瘙痒途径提供了宝贵的见解，有助于开发针对慢性疼痛和持续性瘙痒的靶向疗法。

论文解读：《Frontiers in Molecular Neuroscience》发表关于MrGPRX1内体信号增强TRPV1敏感性以加剧瘙痒的机制研究

研究背景与意义

瘙痒（Pruritus）是一种临床上尚未完全解决的显著问题，被描述为一种引发抓挠欲望的不愉快感觉。作为一种保守的哺乳动物自我保护机制，它有助于物理清除皮肤表面的异物或刺激物。然而，当慢性或剧烈的急性瘙痒得不到妥善管理时，会给患者带来极大的不适。瘙痒影响着四分之一的成年人，严重降低生活质量并增加压力水平，使其成为患者护理中最令人衰弱的状况之一。尽管其普遍性强，但由于其分子、细胞和神经回路机制尚未完全明确，目前可用于管理慢性瘙痒的疗法寥寥无几。因此，表征调节瘙痒的分子和细胞机制对于开发靶向疗法和改善患者预后至关重要。

皮肤上的瘙痒刺激物由表达特定受体和离子通道的外周感觉神经元检测，这些受体和通道能够响应多种热、机械和化学有害刺激。两类关键的瘙痒感应受体是G蛋白偶联受体（GPCR）和瞬时受体电位（TRP）离子通道。GPCR是重要的致痒物检测器，可检测大多数诱发瘙痒的分子，控制组胺依赖性和非依赖性瘙痒通路。同样，TRP通道（如瞬时受体电位香草酸亚型1，TRPV1）在调节瘙痒感觉中也发挥着重要作用。深入理解GPCR与TRP通道之间的相互作用非常必要，因为已知GPCR可调节TRP通道，改变感觉神经元活动并在瘙痒与疼痛感觉之间进行门控转换。

Mas相关G蛋白偶联受体（MrGPR）家族是一类在多种躯体感觉功能中发挥重要作用的GPCR，是瘙痒感觉的关键受体，同时也参与伤害感受。MrGPR在外周感觉神经元、背根神经节（DRG）和三叉神经节（TG）中表达，并与组胺依赖性和非依赖性瘙痒信号通路有关。在MrGPR家族中，灵长类特有的X亚家族（包含4种受体）因其在疼痛、炎症、神经免疫疾病、过敏和瘙痒中的作用而成为极具前景的药理学靶点。其中，人类的MrGPRX1已被确定为抗疟药氯喹（CQ）等致痒物的受体。此外，牛肾上腺髓质（BAM）8–22肽作为内源性致痒物和前脑啡肽A基因产物，对人类MrGPRX1表现出最高的特异性。BAM8-22结合并激活初级感觉神经元上的MrGPRX1，将瘙痒信号从外周传递到中枢神经系统。MrGPRX1是一种Gα_q偶联的GPCR，一旦被细胞外激动剂在细胞表面激活，就会促进细胞内Ca²⁺释放和离子通道激活。激活后，大多数GPCR会被内吞到内体网络中。先前的研究表明，GPCR可以从细胞内细胞器表现出持续的区室化信号，这种延长的信号在与慢性疼痛相关的神经元激活中起关键作用。鉴于MrGPRX1在介导瘙痒中的既定作用，本研究假设MrGPRX1可以从细胞内区室发出信号，并且MrGPRX1的内体信号对于敏化TRPV1通道、导致瘙痒感觉增强至关重要。

主要关键技术方法

本研究采用了多种先进的分子生物学、细胞生物学和动物行为学技术方法。首先，通过构建带有荧光蛋白标签（如mApple、Venus）的MrGPRX1及亚细胞定位标记物（如CAAX、EEA1、Rab5a、Rab7a、Rab11a、FYVE），并结合共聚焦显微镜成像技术，实现了对受体在活细胞中的动态运输和内体定位进行可视化观察与定量分析。其次，利用生物发光共振能量转移（BRET）和纳米比特生物发光共振能量转移（nbBRET）技术，定量检测了激动剂刺激下受体与效应蛋白（如Gα_q、β-arrestin-1）在质膜和早期内体等不同亚细胞区域的实时相互作用。第三，采用基于F?rster共振能量转移（FRET）的ERK活性生物传感器（EKAR），在时空分辨率下监测了细胞质和细胞核中ERK信号通路的激活情况。第四，通过钙离子成像技术，测量了细胞内Ca²⁺浓度变化，以评估TRPV1通道的敏化效应。第五，利用RNAscope原位杂交技术在小鼠背根神经节（DRG）组织中检测了Mrgprx1和Trpv1 mRNA的共表达情况。最后，通过小鼠体内行为学实验，结合鞘内注射各类信号通路抑制剂（如发动蛋白抑制剂Dyngo4a、MEK抑制剂U0126、PKC抑制剂GF109203X、TRPV1拮抗剂SB705498），评估了阻断特定信号通路对BAM8-22诱导的搔抓行为的影响。所有体外细胞实验主要采用HEK293细胞系，而离体神经元实验和体内行为学实验则使用了小鼠模型。

研究结果

BAM8-22刺激MrGPRX1内吞并运输至内体

研究人员通过荧光显微镜观察到，在BAM8-22处理后，MrGPRX1-mApple从质膜耗尽并聚集在早期内体（EEA1阳性）中。过表达发动蛋白显性负性突变体（DynK44A）可抑制MrGPRX1的内化。BRET实验进一步量化了受体的运输过程，证实BAM8-22激活的MrGPRX1-Rluc8与质膜标记物（CAAX-Venus）的BRET信号降低，而与早期内体标记物（Rab5a-Venus）的BRET信号升高，且该过程依赖于发动蛋白。此外，受体还被运输至晚期内体和循环内体。

MrGPRX1内吞介导亚细胞区室的信号传导

通过nbBRET实验，研究人员发现BAM8-22刺激可诱导Gα_q和β-arrestin-1募集到质膜和早期内体，而Gα_i、Gα_s和β-arrestin-2则未被招募至内体。共聚焦显微镜证实了mGα_q向质膜和早期内体的转位，并与MrGPRX1共定位。FRET实验显示，BAM8-22在HEK293细胞中诱导了强烈且持续的细胞质和细胞核ERK激活。使用网格蛋白抑制剂Pitstop2或DynK44A预处理可显著减弱这种激活。在小鼠DRG神经元中，使用腺相关病毒（AAV）表达核EKAR生物传感器，同样证实了发动蛋白抑制剂Dyngo4a可减少BAM8-22诱导的核ERK反应。转录荧光素酶报告基因检测也表明，阻断内吞作用会降低MrGPRX1诱导的血清反应元件（SRE）和活化T细胞核因子反应元件（NFAT-RE）的转录活性。

MrGPRX1对TRPV1通道的敏化受PKC调节

钙成像结果显示，在表达MrGPRX1的HEK293细胞中，BAM8-22引起了细胞内Ca²⁺水平的增加，而共表达TRPV1通道则显著增强了这一钙反应。预先用BAM8-22刺激可增强辣椒素诱导的TRPV1介导的Ca²⁺内流，但这种敏化效应可被PKC抑制剂G? 6983所消除。重要的是，共表达DynK44A以阻断内吞作用也能废除这种MrGPRX1介导的TRPV1敏化。

背根神经节神经元中MrGPRX1对TRPV1通道的敏化

RNAscope原位杂交分析证实，在小鼠DRG神经元中，Mrgprx1和Trpv1 mRNA确实存在共表达，约18%的神经元表达Mrgprx1，26%表达Trpv1，两者共表达比例约为8%。在分离的DRG神经元中进行活细胞钙成像，发现BAM8-22预处理能显著增加辣椒素诱导的TRPV1 Ca²⁺内流，此效应可被PKC抑制剂G? 6983阻断。进一步研究表明，MEK抑制剂U0126或ERK抑制剂FR 180204也能显著抑制这种敏化作用。此外，使用内吞抑制剂Dyngo4a或Pitstop2预处理，同样能有效抑制BAM8-22诱导的TRPV1敏化。

内体MrGPRX1信号介导搔抓行为

小鼠体内行为学实验表明，皮内注射BAM8-22会显著增加动物的总搔抓次数。鞘内预先给予发动蛋白抑制剂Dyngo4a可显著减少BAM8-22引起的搔抓行为。同样，鞘内注射PKC抑制剂GF109203X、MEK抑制剂U0126或TRPV1拮抗剂SB705498，也均能抑制搔抓反应。这些结果表明，MrGPRX1的内吞作用、PKC和MEK/ERK信号通路以及TRPV1通道共同参与了BAM8-22诱导的瘙痒行为。

讨论与结论

本研究首次表征了人类MrGPRX1受体的一种新的信号机制。研究结果证明，MrGPRX1在受到BAM8-22刺激后，会与β-arrestin-1结合，并经历网格蛋白和发动蛋白依赖的内吞作用。此外，研究表明MrGPRX1能够将β-arrestin-1和Gα_q募集到内体区室，并在此处调节细胞质和核ERK的激活。这些数据证实了已知的PKC依赖性MrGPRX1介导的TRPV1敏化，并揭示了一个新的机制，即MrGPRX1的内体信号通过MEK/ERK依赖性通路调节TRPV1敏化。支持这些体外机制性结果的是，研究人员发现当MrGPRX1的内吞作用或PKC/ERK信号受损时，小鼠体内BAM8-22诱导的搔抓行为会显著减弱。总体而言，这些结果表征了一种新的信号机制，即BAM8-22诱导的MrGPRX1激活驱动了内体信号，从而调节初级感觉神经元中的TRPV1敏化和瘙痒传递。

这项研究支持了细胞内GPCR信号事件与慢性疼痛和瘙痒等病理状态相关联的新兴范式。MrGPRX1受体的内体信号传导为调节TRPV1活性提供了机制基础，这对于理解慢性瘙痒的病理生理学具有重要意义。该研究也为开发靶向慢性瘙痒的疗法提供了新的视角，例如通过偏向性激动作用选择性靶向MrGPRX1的内体信号，同时保留质膜信号，从而在避免不必要副作用的同时治疗慢性瘙痒。