源自脂肪干细胞的细胞外囊泡通过miR-23a-5p/PLCD1/PKCA/GluA2轴缓解视网膜兴奋性毒性：一种潜在的治疗策略

《Stem Cell Research & Therapy》：Adipose stem cells derived extracellular vesicles alleviate retinal excitotoxicity via miR-23a-5p/PLCD1/PKCA/GluA2 axis: a potential therapeutic strategy

　　

摘要

背景

尽管兴奋性毒性是多种视网膜疾病中的关键病理机制，但有效的临床干预措施仍然有限。先前的研究表明，脂肪干细胞衍生的细胞外囊泡（ADSC-EVs）可通过抑制蛋白激酶Cα（PKCA）通路并增加细胞膜上α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸受体（AMPARs）亚基2（GluA2）的表达，来减轻谷氨酸诱导的视网膜神经节细胞（RGCs）死亡，但其具体机制尚未明确。

方法

为阐明ADSC-EVs调控细胞内钙平衡的分子机制，我们通过超滤和超速离心法分离出ADSC-EVs，并利用透射电子显微镜、纳米颗粒追踪分析及流式细胞术对这些囊泡进行表征。我们对经ADSC-EVs或PBS预处理后的谷氨酸损伤大鼠视网膜前体细胞（R28）进行了小RNA测序。通过生物信息学分析，我们找到了潜在的微RNA，并预测了它们的目标基因。随后利用碘化丙啶染色、Fluo-4AM染色、Western blotting及免疫荧光技术验证了微RNA的调控作用。此外，还通过计数RGCs数量及视觉功能测试，评估了该微RNA在谷氨酸诱导的SD大鼠模型中的治疗效果。

结果

我们的研究结果表明，ADSC-EVs预处理可显著提高R28细胞中miR-127-3p、miR-181b-1-3p、miR-199a-3p/5p、miR-23a-5p、miR-23b-5p及miR-486的表达水平。生物信息学分析表明，miR-23a-5p可能通过抑制磷脂酶Cδ1（PLCD1）的表达来调节钙超载现象。miR-23a-5p的过表达或ADSC-EVs预处理可通过抑制PLCD1/PKCA/GluA2通路，调节细胞膜上GluA2的表达，从而降低细胞内钙浓度，减少R28细胞的死亡。相反，抑制miR-23a-5p的表达则部分逆转了ADSC-EVs对钙浓度及细胞存活率的调控作用。此外，我们的研究还表明，在视网膜中过表达miR-23a-5p可减轻谷氨酸诱导的RGCs死亡及视觉功能损害，而抑制miR-23a-5p则会加剧此类损伤。

结论

ADSC-EVs释放的miR-23a-5p可通过抑制PLCD1/PKCA/GluA2通路，减轻谷氨酸诱导的RGCs损伤。因此，针对这一由miR-23a-5p介导的通路进行治疗，有望成为治疗兴奋性毒性导致的RGCs损伤的有效方法。

图形摘要

背景

尽管兴奋性毒性是多种视网膜疾病中的关键病理机制，但有效的临床干预措施仍然有限。先前的研究表明，脂肪干细胞衍生的细胞外囊泡（ADSC-EVs）可通过抑制蛋白激酶Cα（PKCA）通路并增加细胞膜上α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸受体（AMPARs）亚基2（GluA2）的表达，来减轻谷氨酸诱导的视网膜神经节细胞（RGCs）死亡，但其具体机制尚未明确。

方法

为阐明ADSC-EVs调控细胞内钙平衡的分子机制，我们通过超滤和超速离心法分离出ADSC-EVs，并利用透射电子显微镜、纳米颗粒追踪分析及流式细胞术对这些囊泡进行表征。我们对经ADSC-EVs或PBS预处理后的谷氨酸损伤大鼠视网膜前体细胞（R28）进行了小RNA测序。通过生物信息学分析，我们找到了潜在的微RNA，并预测了它们的目标基因。随后利用碘化丙啶染色、Fluo-4AM染色、Western blotting及免疫荧光技术验证了微RNA的调控作用。此外，还通过计数RGCs数量及视觉功能测试，评估了该微RNA在谷氨酸诱导的SD大鼠模型中的治疗效果。

结果

我们的研究结果表明，ADSC-EVs预处理可显著提高R28细胞中miR-127-3p、miR-181b-1-3p、miR-199a-3p/5p、miR-23a-5p、miR-23b-5p及miR-486的表达水平。生物信息学分析表明，miR-23a-5p可能通过抑制磷脂酶Cδ1（PLCD1）的表达来调节钙超载现象。miR-23a-5p的过表达或ADSC-EVs预处理可通过抑制PLCD1/PKCA/GluA2通路，调节细胞膜上GluA2的表达，从而降低细胞内钙浓度，减少R28细胞的死亡。相反，抑制miR-23a-5p的表达则部分逆转了ADSC-EVs对钙浓度及细胞存活率的调控作用。此外，我们的研究还表明，在视网膜中过表达miR-23a-5p可减轻谷氨酸诱导的RGCs死亡及视觉功能损害，而抑制miR-23a-5p则会加剧此类损伤。

结论

ADSC-EVs释放的miR-23a-5p可通过抑制PLCD1/PKCA/GluA2通路，减轻谷氨酸诱导的RGCs损伤。因此，针对这一由miR-23a-5p介导的通路进行治疗，有望成为治疗兴奋性毒性导致的RGCs损伤的有效方法。

图形摘要