利用concordex鉴定组织中空间均质区域(Spatial Homogeneous Regions, SHRs)的方法学表征

《BMC Methods》：Characterization of spatial homogeneous regions in tissues with concordex

空间分辨转录组学(Spatially Resolved Transcriptomics, SRT)技术的快速发展促进了对基因表达在组织空间中分布差异的探索。然而，由于细胞类型空间分布带来的混杂变异，识别空间可变基因(Spatially Variable Genes, sp-DEGs)仍然具有挑战性。研究人员提出了一种新方法用于识别细胞类型组成均质的空间域(spatial domains)，以促进将基因表达模式分解为细胞类型效应和空间变异效应。该方法称为concordex，跨技术平台和多种组织类型均表现出高效性与有效性；利用多个生物学数据集，研究人员证明该方法可识别出仅考虑细胞类型变异或仅考虑空间变异时会被遗漏的、具有细微变异模式的基因。concordex工具可在 https://github.com/pachterlab/concordexR免费获取。

一、研究背景与意义

空间分辨转录组学(Spatially Resolved Transcriptomics, SRT)使研究者得以在组织背景下探索基因表达的空间分布，但现有方法识别空间可变基因(Spatially Variable Genes, sp-DEGs)时常受细胞类型空间分布造成的混杂变异干扰——同一空间域内可能含多种细胞类型，而某细胞类型若呈空间局限分布，其标志基因易被误判为sp-DEG。现有空间域(spatial domains/niches)识别方法（如SpaGCN、STAGATE、BANKSY、BayesSpace等）多基于基因表达空间平滑或图神经网络整合空间与表达信息来划分域，其输出"空间域"的定义常与算法本身绑定（即tautological），且未严格以"局部细胞类型组成均质性"为生物学定义依据，难以区分细胞类型驱动的表达差异与真正空间上下文驱动的差异。此外，部分方法需预注释细胞类型，部分无法在细胞类型遍布全组织但仍呈不同比例的区域中正确聚合出宏观空间域。为此，研究人员提出concordex方法，以"空间均质区域(Spatial Homogeneous Regions, SHRs)"——即局部k近邻(k-Nearest Neighbor, kNN)邻域内细胞类型（或连续特征）组成比例相似的区域——为明确定义的生物学对象，先基于空间kNN图的邻域组成相似性划分SHRs，再耦合广义线性模型(Generalized Linear Model, GLM)分离细胞类型与空间效应，发表于《BMC Methods》。

二、主要关键技术方法

研究人员构建空间kNN图（Visium默认k=12，其他单细胞分辨率SRT默认k=30），以离散细胞类型注释或连续向量（如前50个主成分Principal Components, PCs）标记节点，计算n×m邻域合并矩阵(Neighborhood Consolidation Matrix, K)，元素K_ij为细胞i的k个最近邻中被赋予标签j（离散情形）或连续特征均值（连续情形）的比例/中心质量；对该矩阵行向量聚类（已知域数用k-means，未知用Leiden或Louvain算法）得到SHRs。下游差异表达采用负二项广义线性模型(Negative Binomial GLM, NB-GLM)，以细胞类型、SHR及二者交互项为固定效应，文库大小(library size)为偏移量(offset)，用INLA包拟合，按效应大小分类基因为细胞类型主导、空间主导或交互主导。测评采用模拟棋盘格(chessboard)与层状(stripe)数据集、10x Visium人背外侧前额叶皮层(Dorsolateral Prefrontal Cortex, DLPFC)12个切片（有组织学层注释作为金标准）、STARmap小鼠原初视皮层(primary visual neocortex)、Slide-Seq V2小鼠小脑、Visium HD小鼠小肠及MERFISH小鼠肝脏数据，以调整互信息(Adjusted Mutual Information, AMI)、调整兰德指数(Adjusted Rand Index, ARI)及运行时间评估。

三、研究结果

Neighborhood consolidation with concordex

研究人员说明concordex工作流程：从空间坐标建kNN图G=(V,E)，V为细胞/spot，E基于欧氏距离；给节点赋离散（细胞类型）或连续（PCs）标签后算邻域合并矩阵K；聚类K的行得SHRs——同一SHR内细胞具相似邻域组成（即相似细胞类型/特征比例）。该矩阵亦可用于非空间scRNA-seq中以评估簇间关系与簇内异质性。

Benchmarking concordex on control and biological spatial datasets

在两类模拟数据（棋盘格含两细胞类型不同比例区域、顺序层状排布）上，concordex准确重构区域边界且各SHR含预期细胞类型比例，性能优于BayesSpace与SpaGCN（后两者倾向于还原细胞类型分配而非聚合区域）、Giotto与GASTON（未产出清晰棋盘）；与STAGATE、BANKSY相当。在人DLPFC Visium数据（用前50 PCs算K，因无斑点级细胞类型注释）12个切片中，concordex一致识别皮质层，AMI优于或等同于对照方法且层界限更清晰。在MERFISH小鼠肝数据不同抽样规模下，concordex为最快方法；应用于Visium HD小鼠小肠成功识别绒毛(villus)、隐窝(crypt)及肌层结构。

Improved identification of layers in the mouse neocortex using concordex

对STARmap小鼠原初视皮层数据（具细胞类型与解剖层注释，用前50 PCs作连续标签），concordex预测SHRs与人工注释吻合（AMI/ARI优于对照法），且各预测SHR内细胞类型比例符合对应皮质层预期（即便某细胞类型跨多层存在如eL2/3于L1与L2/3仍可区分），已知标记基因（Slc17a7、Lamp5、Pcp4）表达空间分布匹配预测SHRs，验证SHRs基于邻域组成而非单基因表达划分的价值。

Identification of spatially variable genes

对Slide-Seq V2小鼠小脑数据，concordex识别SHRs与Allen脑参考图谱吻合（用细胞类型或前50 PCs算K所得SHRs内细胞类型比例相近）。NB-GLM检出1246个受细胞类型、SHR或交互效应显著影响的基因：无交互作用基因以细胞类型效应为主且与Moran's I相关性弱；有交互作用基因显示强空间自相关且总效应更大，多数以细胞类型-交互效应为主（即特定细胞类型在特定SHR中的表达），少数为空间-交互主导如Aldoc——Purkinje细胞特异且在小脑呈副矢状带(parasagittal bands)空间模式，空间-交互效应超过细胞类型-交互效应，体现concordex+GLM能捕获细微空间变异模式。

四、讨论与结论翻译

研究人员指出concordex基于局部邻域组成相似性显式定义并识别空间均质区域(SHRs)，适用于Visium、Visium HD、MERFISH、成像质谱细胞术等多平台；支持连续特征输入使其在缺细胞类型注释时仍可用，弥补了需预注释细胞类型的局限；相比依赖基因表达空间平滑或增维的方法计算更高效（近邻与聚类算法优化），适合高通量大细胞数SRT数据。concordex区分细胞类型赋值与区域赋值，能识别组织中空间相隔但组成相似的SHRs。邻域合并矩阵亦可用于非空间scRNA-seq评估簇边界与异质性。局限在于若同型细胞密集成片且邻域完全相同可能并为一个SHR，但这反映组织真实组成均质情况。未来可聚焦区域限制表达基因与细胞类型定位的区分。

研究结论：concordex为跨空间尺度与技术平台识别空间均质区域(SHRs)提供了准确高效的框架，推进了对复杂空间区域化模式的理解；其所识别SHRs能为后续分析提供重要见解，助力组织复杂性解析。