鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）通过hmgb1基因调控增强斑点叉尾鲶（Pangasianodon hypophthalmus）免疫力与嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）感染后的存活率

《The Journal of Basic and Applied Zoology》：Lactobacillus rhamnosus boosts immunity and survival in striped catfish (Pangasianodon hypophthalmus) via hmgb1 gene modulation against Aeromonas hydrophila infection

　　

摘要：益生菌日益广泛地应用于水产养殖中以改善生长性能、增强免疫应答并减少抗生素依赖。本研究评估了饲粮中添加鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）对斑点叉尾鲶（Pangasianodon hypophthalmus）生长性能、非特异性免疫、血清生化指标及抗嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila，ATCC 7966）抗病力的影响。设45 d摄食试验，分为对照组及三个益生菌处理组（1×108、2.5×108和5×108CFU/g饲料），每组三个重复。结果显示，投喂2.5×108CFU/g（T2组）的鲶鱼综合表现最佳，较对照组（P＜0.05）显著改善生长，并增强先天免疫应答，包括更高的氮蓝四唑（Nitroblue Tetrazolium，NBT）活性、溶菌酶（Lysozyme）及髓过氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）水平。益生菌补充亦改善血清蛋白谱，总蛋白、白蛋白和球蛋白升高，血清葡萄糖、谷丙转氨酶（Serum Glutamic-Pyruvic Transaminase，SGPT）和谷草转氨酶（Serum Glutamic-Oxaloacetic Transaminase，SGOT）水平较对照组降低。表达分析显示各检测组织中hmgb1基因显著受调控（P＜0.05），益生菌摄食期间hmgb1下调，而细菌攻毒后免疫相关器官（肾和脾）中hmgb1上调。此外，益生菌组鲶鱼经A. hydrophila攻毒后存活率更高。综上，饲粮添加2.5×108CFU/g鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）在促进P. hypophthalmus生长、提高免疫能力及抗A. hydrophila感染方面表现较优。

论文解读——鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）通过hmgb1基因调控增强斑点叉尾鲶（Pangasianodon hypophthalmus）抗嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）感染免疫与存活率

一、研究背景与意义

水产养殖是全球重要的动物蛋白来源，斑点叉尾鲶（Pangasianodon hypophthalmus）在东南亚具重要商业价值。集约化养殖使鱼群易受细菌性病原侵染，其中嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）可致运动性气单胞菌败血症（Motile Aeromonad Septicaemia，MAS），造成高死亡率和经济损失。抗生素滥用带来耐药性与残留问题，益生菌作为生态友好型生物防控剂受到关注。乳酸杆菌属（Lactobacillus spp.）已在多种鱼类中证实可改善生长并增强先天免疫，但鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）对P. hypophthalmus的作用及其分子免疫调节机制尚不清楚。高迁移率族蛋白B1（High-Mobility Group Box 1，HMGB1/hmgb1）是保守的核内DNA结合蛋白，胞外作为损伤相关分子模式（Damage-Associated Molecular Patterns，DAMPs）参与炎症调控，在硬骨鱼中已被证明受病原诱导并与抗病相关，是潜在的免疫生物标志物。本研究将益生菌介导的免疫增强与hmgb1表达关联，探讨L. rhamnosus对P. hypophthalmus生长、非特异性免疫、血清生化及抗A. hydrophila抵抗力的调控作用及其对hmgb1基因表达的影响，为水产养殖疾病监测与益生菌应用提供理论依据。本研究成果发表于《The Journal of Basic and Applied Zoology》。

二、主要关键技术方法概述

研究人员选用无病P. hypophthalmus苗种（9–11 cm，6–8 g，n=225），随机分入4组（对照及1×10⁸、2.5×10⁸、5×10⁸CFU/g饲料的L. rhamnosus MTCC 12920益生菌组），每组3重复（15尾/缸），进行45 d饱食投喂试验。定期测定增重（Weight Gain，WG）、特定生长率（Specific Growth Rate，SGR）和饵料系数（Feed Conversion Ratio，FCR）。45 d末采集尾静脉血检测NBT活性、溶菌酶、髓过氧化物酶（MPO）、总蛋白、白蛋白、球蛋白、血糖、SGPT、SGOT及碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）。取肝、肠、鳃、肾、脾组织，提取总RNA反转录为cDNA，采用实时荧光定量PCR（quantitative Real-Time PCR，qPCR）以β-actin（ACTB）为内参，用2^-ΔΔCt法分析hmgb1mRNA相对表达量（引物针对GenBank XM_026935153.2设计）。45 d饲喂结束后，各处理组腹腔注射A. hydrophila（ATCC 7966）LD₅₀剂量（2.3×10⁷CFU/mL），连续观察10 d记录累积死亡率并行Kaplan–Meier生存分析与log-rank检验。生长与免疫生化数据以单因素方差分析（One-Way ANOVA）及Duncan多重比较检验，P＜0.05为差异显著。

三、研究结果

益生菌在喷覆饲料中的活力与回收

喷覆益生菌的饲料在制备后第7天活菌计数分别为T1≈1.1×10⁸、T2≈2.56×10⁸、T3≈5.1×10⁸CFU/g，与目标添加量吻合，表明益生菌在饲料中7 d内保持稳定，可实现目标剂量递送。

生长性能（Growth performance）

45 d饲喂后，各益生菌组终末体重、增重（WG）、增重率和SGR均显著高于对照组（P＜0.05），FCR显著低于对照组。其中T2组（2.5×10⁸CFU/g）增重最高（13.78 g）、SGR达2.60%、FCR最低（1.11），综合生长表现最优，表明该剂量L. rhamnosus可有效促进P. hypophthalmus生长并提高饲料利用率。

非特异性免疫应答（Non-specific immune response）——免疫学检测

益生菌组NBT活性、溶菌酶活性及MPO活性均显著高于对照组（P＜0.05）。T2组NBT活性（0.173）和MPO（0.536 U）最高，溶菌酶（138 U）亦最高，T3次之，T1再次之。说明L. rhamnosus饲粮可激活鲶鱼呼吸爆发（Respiratory Burst）及吞噬相关酶系，增强先天免疫防御。

非特异性免疫应答——血清生化检测（Serum biochemical assays）

益生菌组血清总蛋白、白蛋白、球蛋白均显著高于对照组（P＜0.05），T2组最高（总蛋白2.08 g/dL、白蛋白0.84 g/dL、球蛋白1.24 g/dL）。血糖在T2组显著降低（43 mg/dL vs 对照69 mg/dL），提示低应激状态。ALP各组间无显著差异。SGPT和SGOT在益生菌组显著低于对照组（P＜0.05），T2组最低（SGPT 3.14 U/L，SGOT 47.55 U/L），提示肝脏功能未受损且生理状态良好。表明L. rhamnosus提升免疫相关血清蛋白合成并减轻代谢应激。

hmgb1基因表达（hmgb1 gene expression）

饲喂期第15、30天，益生菌组肝、肠、鳃中hmgb1显著下调（P＜0.05）；第45天所有检测组织（肝、肠、鳃、肾、脾）hmgb1均较对照组显著下调，说明长期益生菌摄入抑制基础状态下促炎相关hmgb1组成性过表达。攻毒后肝、肠hmgb1组间无显著差异，鳃hmgb1在益生菌组更低，而肾和脾中hmgb1较对照组显著上调——符合硬骨鱼受A. hydrophila感染后免疫器官hmgb1被诱导参与抗菌防御的特征，提示益生菌预处理使鱼保有正常的病原诱导型hmgb1应答能力。

攻毒后存活率（Post challenge survival）

A. hydrophila攻毒10 d观察期内，对照组累积存活率为48.88%，T1为51.11%，T2为62.22%，T3为57.77%。T2组存活率最高，Kaplan–Meier分析显示组间差异显著（log-rank test，P＝0.0290）。证实饲粮添加L. rhamnosus可提高P. hypophthalmus抗A. hydrophila感染的抗病力，以2.5×10⁸CFU/g效果最佳。

四、讨论与结论总结

讨论部分指出，L. rhamnosus改善生长可能源于肠道微生态平衡及消化酶活化，与已有乳酸菌研究一致。非特异性免疫指标升高与先前Bacillus及Lactobacillus spp.报道相符，反映益生菌定植刺激吞噬细胞活性与抗菌肽/酶分泌。血清总蛋白与球蛋白上升提示免疫球蛋白及急性期蛋白合成增强，血糖下降反映低皮质醇应激状态，肝酶降低说明无肝损伤。hmgb1在稳态下被益生菌下调，可能与益生菌抑制促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β等）及NF-κB通路活化有关，从而限制基础炎症；感染时肾、脾hmgb1正常上调，符合HMGB1作为DAMP分子在抗感染免疫中的双重角色，表明益生菌调节而非抑制必要的免疫防御反应。存活率提升与免疫增强及hmgb1适度调控相呼应。

结论（Conclusion）：

综上所述，斑点叉尾鲶（Pangasianodon hypophthalmus）饲粮中添加鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）可调控免疫相关调节基因hmgb1的表达，同时改善生长性能、增强先天免疫应答并提高对嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）感染的抵抗力。在测试剂量中，2.5×10⁸CFU/g饲料表现出相对更优的综合效应；但其作为最适剂量在不同养殖条件下的适用性尚需进一步验证。