非典型畸胎样/横纹肌样瘤（AT/RT）进展过程中与上皮-间质转化及细胞外基质变化相关的分子改变

《Acta Neuropathologica》：Molecular changes during AT/RT progression associated with epithelial–mesenchymal transition and extracellular matrix changes

　　

摘要：非典型畸胎样/横纹肌样瘤（AT/RT）是婴儿期最常见的恶性脑肿瘤，预后极差。大多数患者遭受肿瘤进展或复发，但其潜在机制尚不清楚。为了更好理解这些机制，研究人员对八对配对的原发肿瘤和复发肿瘤进行了单细胞核RNA测序（snRNAseq）。肿瘤细胞和肿瘤微环境（TME）的细胞被分别分析。通过使用CIBERSORT比较原发和复发肿瘤细胞群体的全局基因表达谱，识别出潜在的治疗抵抗性肿瘤细胞。通过组织病理学、体外实验、批量RNA测序和生存分析进行验证。配对的原发和复发AT/RT显示出显著的基因表达谱差异。潜在的治疗抵抗性AT/RT-MYC肿瘤细胞揭示了细胞外基质（ECM）的变化，以及发育过程和免疫信号通路的改变。相应的基因特征与AT/RT-MYC患者较差的生存期相关。复发的AT/RT-MYC肿瘤细胞经历了部分上皮-间质转化（pEMT），这一特征通过免疫组织化学（IHC）和分析体外标准治疗后AT/RT细胞得到证实。总之，研究人员确定了AT/RT中肿瘤复发和治疗抵抗的潜在机制，这些机制可用于未来改善治疗。

论文解读

**研究背景与意义**
非典型畸胎样/横纹肌样瘤（AT/RT）是主要影响幼儿的中枢神经系统（CNS）恶性肿瘤，以侵袭性、浸润性生长和极差的预后为特征，中位总生存期（OS）根据风险组不同在9至17个月之间。绝大多数AT/RT患者会经历肿瘤进展或复发，这表明该肿瘤存在显著的治疗抵抗性。尽管先前的研究已发现配对原发与复发AT/RT在组织学、增殖活性、拷贝数变异和批量基因表达谱方面存在差异，但治疗抵抗性肿瘤细胞的具体识别及其分子机制仍不清楚。因此，迫切需要深入表征治疗抵抗性和复发性AT/RT肿瘤细胞，以识别克服抵抗性的新治疗靶点。本研究旨在通过单细胞核水平解析AT/RT原发与复发肿瘤的转录组差异，识别并表征与原发肿瘤相似、可能具有治疗抵抗潜力的细胞亚群，为理解AT/RT的复发机制和开发新疗法提供依据。该论文发表在《Acta Neuropathologica》上。

**关键技术方法概述**
本研究主要采用了以下关键技术方法：1. **单细胞核RNA测序（snRNAseq）**：对来自8名患者的16个配对原发和复发AT/RT福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本进行测序，使用10× Genomics平台，旨在解析肿瘤细胞和肿瘤微环境（TME）的单细胞转录组图谱。2. **生物信息学分析**：利用Seurat、CIBERSORT、inferCNV、NMF（非负矩阵分解）、Reactome通路富集分析等多种算法和工具进行数据整合、聚类、差异表达基因鉴定、细胞通讯推断和癌症细胞状态注释。3. **验证实验**：包括**免疫组织化学（IHC）** 对配对患者样本进行上皮膜抗原（EMA）等蛋白表达验证；**体外细胞培养与药物处理**，使用患者来源的AT/RT-MYC细胞系（BT-16和CHLA-266）模拟标准化疗（多柔比星、依托泊苷、长春新碱）并评估治疗抵抗性；**批量RNA测序（bulk RNAseq）** 对处理前后的细胞系进行转录组分析；以及**生存分析**，基于已发表的AT/RT-MYC患者队列批量RNAseq数据，评估特定基因特征与患者预后的关联。

**研究结果**

**单细胞核RNA测序分析揭示配对原发与复发AT/RT具有不同的基因表达谱**
对8名患者的16个样本进行snRNAseq分析，共获得15,399个细胞。通过UMAP降维和拷贝数变异（CNV）分析，清晰区分了肿瘤细胞和TME细胞。TME细胞被注释为不同的细胞类型。差异丰度测试发现，复发AT/RT中**CD1A⁺ CD207⁺ 树突状细胞（DCs）** 显著富集。这一发现通过IHC和既往批量RNAseq数据的反卷积分析得到验证。此外，肿瘤中存在此类细胞的患者总生存期（OS）显著更短。细胞通讯分析推断，复发AT/RT中TGF-β1和TGF-β2诱导的信号传导可能促进了这些DCs的出现。肿瘤细胞分析显示，AT/RT-MYC亚型存在患者特异性差异，而AT/RT-TYR亚型肿瘤细胞基因表达谱更相似。重要的是，配对的原发和复发肿瘤样本显示出截然不同的基因表达谱。

**与复发高度相似的AT/RT-MYC原发肿瘤细胞以ECM重塑、发育过程和免疫通路改变为特征**
针对AT/RT-MYC亚型（4名患者）进行深入分析。对原发和复发肿瘤细胞分别整合聚类后，在原发肿瘤中识别出7个Seurat簇，在复发肿瘤中识别出6个Seurat簇。通过CIBERSORT分析发现，原发肿瘤簇2、4和5与复发肿瘤簇的相似度最高，这些细胞在所有样本中均存在，被定义为潜在的治疗抵抗性细胞。通路富集分析显示，这些细胞中上调的基因主要富集于**细胞外基质（ECM）组织**、**免疫系统相关通路**（如细胞因子信号传导）、**发育过程**、**代谢过程**、**信号转导**和**止血**等通路。复发AT/RT-MYC与原发肿瘤相比，也上调了相似的基因和通路。

**治疗抵抗相关基因在未复发的AT/RT-MYC中表达较低**
为了验证上述基因特征是否与复发发展相关，研究人员将未复发的AT/RT-MYC肿瘤样本整合到分析队列中。比较发现，在已复发的AT/RT-MYC原发肿瘤中，与ECM组织、免疫系统通路和发育过程等相关的大量基因表达上调。更重要的是，在潜在治疗抵抗性细胞中鉴定出的大多数基因，在已复发肿瘤中的表达水平显著高于未复发肿瘤，这支持了这些基因特征驱动AT/RT-MYC肿瘤进展和复发的假设。

**AT/RT-MYC复发肿瘤中经历部分上皮-间质转化（pEMT）的细胞比例增加**
通过NMF分析将每个AT/RT-MYC肿瘤细胞注释到四种癌症细胞状态：“细胞周期”、“干扰素反应”、“代谢/氧化磷酸化（OXPHOS）”和“部分上皮-间质转化（pEMT）”。量化结果显示，复发AT/RT-MYC中处于pEMT状态的细胞比例显著增加。使用泛癌症细胞状态图谱进行验证也得到了相同结论。IHC对配对样本进行EMA（上皮标志物）染色显示，在5对样本中的3对，复发肿瘤的EMA阳性区域减少，表明上皮特征减弱。体外实验中，用标准化疗药物处理AT/RT-MYC细胞系后，细胞出现EMA表达下降、细胞密度降低、细胞间距离增大等形态学改变，提示向间质表型转变。批量RNAseq证实，处理后的细胞中pEMT标志基因以及潜在治疗抵抗性细胞中上调的顶级基因（如ETS1）均表达上调。鉴于ETS1与治疗抵抗和pEMT相关，研究人员测试了ETS1抑制剂TK216与标准化疗联用的效果。结果显示，联合TK216能显著抑制两种AT/RT-MYC细胞系在处理后的再生长，表明靶向pEMT可降低治疗抵抗性。

**过表达治疗抵抗相关基因的AT/RT-MYC患者生存期更差**
基于25例AT/RT-MYC原发肿瘤的批量RNAseq数据队列进行生存分析。将患者分为高表达和低表达潜在治疗抵抗性细胞特征基因的两组。多变量分析显示，高表达该基因特征的患者具有显著更差的总生存期（OS）和无进展生存期（PFS），且年轻年龄也是不良预后因素。进一步比较长期生存者与短期生存者的基因表达谱，发现上调的通路与在潜在治疗抵抗性细胞及复发肿瘤中富集的通路有重叠，包括**细胞因子信号传导**、**发育生物学**、**止血**以及功能上与**ECM组织**相似的胶原相关通路。此外，对潜在治疗抵抗性细胞中上调最多的五个基因（ETS1、LAPTM5、LPL、CRIP1、C1QB）进行分析，发现高表达ETS1和LAPTM5与AT/RT-MYC患者较差的生存期显著相关。

**讨论与结论**
本研究通过snRNAseq深入揭示了AT/RT原发与复发肿瘤在肿瘤细胞和TME层面的分子差异。首次在AT/RT复发TME中发现并验证了**CD1A⁺ CD207⁺ DCs**的富集及其与不良预后的关联，其激活可能与TGF-β信号有关。研究成功识别出AT/RT-MYC原发肿瘤中与复发高度相似、潜在具有治疗抵抗性的细胞亚群，其特征是**ECM重塑**、**免疫/细胞因子信号通路**和**发育过程**的改变。这些细胞中过表达的基因特征在未复发肿瘤中表达较低，且与患者不良生存显著相关，证实了其在驱动复发中的关键作用。研究进一步证明，AT/RT-MYC复发与**部分上皮-间质转化（pEMT）** 增加有关，这一现象在患者样本和体外药物处理模型中均得到验证。靶向pEMT相关因子ETS1能增强化疗敏感性，为联合治疗提供了新思路。

**结论**：总之，研究人员确定了AT/RT中肿瘤复发和治疗抵抗的潜在机制，包括增加的ECM重塑和pEMT，这些应被视为新型治疗方法的靶点。