人β-淀粉样蛋白(β-amyloid, Aβ)至堤岸田鼠(bank vole)啮齿动物模型的朊病毒样传播与扩增

《Acta Neuropathologica》：Prion-like transmission and propagation of human β-amyloid to the bank vole rodent model

　　

过去数十年间，不断增多的实验与观察证据表明，阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)的特征性病理蛋白——Aβ与磷酸化Tau(hyperphosphorylated Tau, pTau)，可能通过朊病毒样(prion-like)机制沿神经系统扩散。研究人员通过将4例散发性AD(sporadic AD, sAD)及5例家族性AD(familial AD, fAD)患者的大脑匀浆接种至对朊病毒疾病高度敏感的野生型堤岸田鼠(bank vole, Myodes glareolus)体内，探究Aβ与pTau的可传播性。研究人员观察到：(i) 受体田鼠脑内诱导出新形成的Aβ沉积物与pTau包涵体；(ii) Aβ病理呈现特定的神经嗜性分布模式；(iii) Aβ蛋白病可通过田鼠-田鼠(vole-to-vole)接种发生传代扩增(propagation)。本研究首次提供实验证据证明人源Aβ种子(seed)可传递至野生型啮齿类动物模型，进一步支持Aβ具有朊病毒样性质。结果有力支持近期关于医源性(iatrogenic) Aβ传播的研究发现，强调需评估Aβ种子暴露对人类健康的潜在影响。

人β-淀粉样蛋白(Aβ)至堤岸田鼠模型的朊病毒样传播与扩增——论文解读

本文发表于《Acta Neuropathologica》。阿尔茨海默病(AD)以脑内细胞外Aβ沉积及细胞内由高磷酸化微管相关蛋白Tau(hyperphosphorylated Tau, pTau)组成的神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFTs)为核心病理特征，假说认为二者可能以朊病毒样播种聚合(seeded aggregation)方式沿神经连接传播。既往Aβ传播证据多来自转基因小鼠及非人灵长类(其APP序列与人高度同源且老龄可自发产生Aβ)，缺乏野生型、无自发性Aβ沉积的啮齿类模型直接证据；同时医源性Aβ传播(如尸源性人生长激素c-hGH污染致接受者脑内Aβ沉积)的人体观察报道日益增多，亟需合适野生型模型验证人Aβ种子的跨物种传播与传代能力。堤岸田鼠(Myodes glareolus)是已知对多种人与动物朊病毒毒株高度敏感的野生型啮长爪沙鼠近缘种，且此前研究提示其经fAD患者脑匀浆接种可诱导pTau病变，但Aβ在其体内的传播尚未见报道。本研究旨在验证人AD脑内Aβ及pTau种子能否在野生型堤岸田鼠中诱导新生病理并发生种内传代，以明确Aβ的朊病毒样传播属性。

研究人员收集4例sAD及5例fAD(携带APP-A673V、APP-A713T、PS2-A85V、PS1-S169L、PS1-P117A突变)患者海马/皮层脑组织，设3例非痴呆对照(年轻及高龄健康人)；将20%人脑匀浆或田鼠脑匀浆行左侧脑实质内单点接种8周龄野生型堤岸田鼠及对照C57BL/6J小鼠，定期处死取材并行福尔马林固定与-80℃冻存；采用Bielschowsky银染、Thioflavin S(ThS)荧光染色及免疫组化(IHC，抗Aβ 4G8、抗Aβ₄₀克隆11A50-B10、抗Aβ₄₂克隆12F4、抗人特异性Aβ N端6E10，抗pTau AT8/AT180/PHF-1)检测病理；取首代Aβ阳性田鼠脑行田鼠-田鼠二次传代；Western blot检测全长APP(FL-APP)及C端片段，Sanger测序获田鼠APP cDNA并比对人/小鼠序列；ELISA定量不溶组分Aβ₄₂含量；免疫荧光双标观察胶质细胞(GFAP⁺星形胶质细胞、Iba1⁺小胶质细胞)与Aβ/pTau共定位；统计采用Mann-Whitney及Kruskal-Wallis检验等。

Prion-like transmission of human-Aβ to vole / Human-Aβ and -pTau are transmissible to vole

将sAD(4/4批次)及部分fAD(PS1-S169L、PS1-P117A、PS2-A85V，3/5批次；APP突变株A673V与A713T未诱导Aβ)人脑匀浆接种田鼠后，12个月post-inoculation(m.p.i.)起偶见Aβ沉积，18 m.p.i.后较一致检出，主要位于海马下托(subiculum)斑片/弥漫沉积及海马伞(alveus)颗粒状聚集，经4G8、Bielschowsky银染及ThS确认；6E10抗体阴性排除为人源残留Aβ，证实为新合成田鼠Aβ。pTau包涵体(AT8⁺神经毡丝与少突胶质细胞卷曲小体)于6–12 m.p.i.见于多数sAD与fAD接种组，主要位于胼胝体压部及海马伞。对照(健康人脑匀浆及77只未接种老龄田鼠)均无Aβ沉积。结论：人AD脑Aβ与pTau种子可在野生型堤岸田鼠诱导新生相应蛋白病变，且田鼠不自发产生Aβ amyloidosis。

Vole-to-vole Aβ transmission

选取首代fAD-PS1-#1诱导的高Aβ负荷田鼠脑匀浆(bv#3、bv#9)接种二级受体田鼠，阴性对照为Aβ阴性接种田鼠及未接种老龄田鼠脑匀浆。18 m.p.i.始见个别受体Aβ阳性，26 m.p.i.分别有2/3及1/3阳性，沉积形态与首代相似(下托斑块及海马伞颗粒聚集，含Aβ₄₂⁺仅Aβ₄₀^-)；pTau未在二代检出，阴性对照全程Aβ阴性。结论：田鼠来源的Aβ种子可在同种野生型个体内完成二次传代扩增，具朊病毒样种内传播能力。

Neuropathological analysis of induced Aβ deposits / Morphology and distribution of Aβ deposits in vole brains

首代及二代Aβ沉积呈两类形态：①下托区焦点状斑块样或弥漫沉积(直径10–40 μm，4G8⁺、银染纤丝网、弱ThS荧光)；②海马伞及背侧海马裂散在颗粒状聚集(部分密集核心ThS强荧光)。罕见血管周沉积。未见Aβ与GFAP⁺/Iba1⁺胶质细胞共定位。二代以稀少小斑块及海马伞颗粒为主。抗Aβ亚型抗体示所有Aβ阳性田鼠脑内仅Aβ₄₂被检出，无Aβ₄₀信号，与原发及传代一致。半定量评分及ELISA显示fAD-PS1-#2组不溶Aβ₄₂高于健康对照(p=0.0098)。结论：诱导Aβ具特定海马结构嗜性及典型淀粉样形态，且选择性富集Aβ₄₂亚型。

Morphology and distribution of pTau inclusions

pTau于首代为神经毡丝(thread)与少突胶质细胞卷曲小体(coiled body)，位于胼胝体压部及海马伞，偶见皮层星型/神经元胞内pTau；形态不因供体AD类型或潜伏期改变。二代传代未检出pTau。结论：人源pTau可在田鼠初代诱导典型病变但未能同种传代。

Comparative analysis of Aβ seeding activity between bank voles and C57BL/6J mice

相同fAD-PS1-#1匀浆接种C57BL/6J小鼠至24 m.p.i.，未见Aβ沉积(虽可诱导pTau且程度高于田鼠)，对照健康人脑匀浆亦阴性。田鼠与小鼠APP₆₉₅cDNA测序显示Aβ区段(597–638 aa)序列完全一致；全APP比对人-田鼠97.41%、田鼠-小鼠99.42%，小鼠酸性域(Acidic domain, AcD)第195位(N→S)及272位(I→T)与田鼠/人不同。Western blot示两物种全长APP(FL-APP)及基础Aβ₄₂无差异。结论：野生型小鼠对人不发生Aβ播种，田鼠敏感性不源于APP表达量或Aβ本底，可能与APP胞外域非Aβ区(如AcD 195/272位)结构兼容性及/或PrP^C介导摄取有关。

讨论总结(含研究结论翻译)

本研究首次证明人源Aβ种子可在不伴自发性Aβ沉积的野生型啮齿类(堤岸田鼠)脑内诱导新生Aβ病变并可同种传代，支持Aβ具朊病毒样传播属性。田鼠无老龄自发Aβ沉积，支持病变为外来种子驱动的新形成(de novo induction)而非加速内源性老化过程。Aβ病变具海马下托与海马伞特异性分布，传代后保留此神经嗜性。仅Aβ₄₂亚型被诱导，与供体中Aβ₄₂高播种活性相符。二代仅传Aβ不传pTau，与人医源性暴露主要见Aβ沉积现象吻合。田鼠对Aβ传播敏感性高于C57BL/6J小鼠，非因APP表达或Aβ本底差异，推测与APP酸性域195(N)、272(I)位点与人一致及朊病毒蛋白PrP^C潜在参与有关。结论如下翻译自原文："The main finding of our study is the demonstration that human Aβ (hu-Aβ) seeds are transmissible in a wild-type rodent and can propagate in a novel non-human host in a prion-like manner, further confirming that Aβ seeds fulfill the prion transmissibility paradigm."(本研究主要发现是证明人Aβ种子可在野生型啮齿动物中传播，并能以朊病毒样方式在新非人类宿主中扩增，进一步确认Aβ种子满足朊病毒传播范式。)