基于计算方法的天然及合成抑制剂筛选：针对胰腺癌中KRAS突变体（G12D、G12V和G12C）及野生型的抑制剂识别

《Journal of Molecular Graphics and Modelling》：In Silico Identification of Natural and Synthetic Inhibitors Targeting KRAS Mutants (G12D, G12V, and G12C) and Wild-Type in Pancreatic Cancer

　　赫曼塔·马尼·库马尔·查克拉瓦蒂·钱达 | 苏迪尔·库马尔·卡塔里
印度安得拉邦瓦德拉穆迪-522213，维格南科学、技术及研究基金会生物技术及生物信息学部门

1. 摘要
胰腺癌是一种恶性程度极高的癌症，预后极差，其主要驱动因素为致癌性的KRAS突变。其中，G12D和G12V等第12密码子突变最为常见，这类突变会持续激活促进细胞增殖和存活的信号通路。本研究采用整合的计算机模拟方法，筛选出可靶向野生型以及G12D、G12V、G12C突变型的KRAS蛋白的潜在抑制剂。研究过程中进行了虚拟筛选、分子对接、分子动力学模拟、密度泛函理论计算以及药代动力学与药效学分析。包括吡布特罗、莱沃诺尔德弗林、穆吉酸、伊里林D、DH-DMX和DXP在内的多种化合物，其结合亲和力均优于参考抑制剂MRTX1133、Daraxonrasib和Adagrasib。分子动力学模拟和主成分分析表明，这些化合物能与KRAS蛋白形成稳定的结合，且存在稳定的氢键作用模式。密度泛函理论分析有助于了解这些化合物的电子性质与反应活性，而药代动力学与药效学分析则显示它们具有较好的药代特征。值得注意的是，莱沃诺尔德弗林对多种KRAS突变型都具有稳定的结合能力。这些研究结果为后续的实验验证提供了潜在候选物，同时也体现了在胰腺癌治疗中运用计算机模拟方法进行KRAS靶点药物研发的重要性。

引言
胰腺癌是一种极具侵袭性和致命性的恶性肿瘤，其特征是病情进展迅速、早期就会发生转移，且对传统治疗方法存在显著耐药性。尽管在癌症诊断和治疗方面已取得一定进展，但由于往往在疾病晚期才被确诊，加之可选的治疗方案有限，胰腺癌的预后依然极为不良。该疾病在早期通常没有明显症状，加之其位于人体深处，进一步增加了早期发现的难度，因此大多数患者在已经无法通过手术治愈时才被确诊[1]。

从流行病学角度来看，胰腺癌是全球范围内日益严重的健康问题。在所有实体瘤中，胰腺癌的生存率最低，多项研究显示其5年总体生存率仅在3%到11%之间[1][2]。死亡率与发病率大致相当，这反映出当前治疗策略的效果十分有限[3]。在美国，胰腺癌是目前第四大癌症相关死亡原因，约占所有癌症死亡的7%-8%，而全球范围内每年新增胰腺癌病例超过45万例，死亡人数超过43万例[4][5]。

患者的生存情况在很大程度上取决于确诊时的疾病分期。仅有15%-20%的患者属于可手术切除的类型，这类患者通过手术治疗才有较大的机会实现长期生存[6]。即便如此，他们的中位生存期也只有14到20个月，5年生存率约为18%-27%，而且大多数患者在手术后一年内就会出现疾病复发[7][8]。相比之下，近80%的患者被诊断为局部晚期或已发生转移的胰腺癌，这类患者的中位生存期通常不足12个月，5年生存率则降至约2%[2]。

尽管已经采用了FOLFIRINOX、吉西他滨联合纳布帕利塔克塞等现代多药化疗方案，但患者的生存改善仍然有限。对于已发生转移的胰腺癌患者，其总体中位生存期仍在8到11个月之间，这凸显出在晚期胰腺癌治疗方面仍存在诸多局限[9]。此外，患者的预后还受到年龄、肿瘤分期、淋巴结受累情况以及治疗方式等多种因素的影响，其中年龄较大和疾病分期较晚的患者，其死亡风险显著更高[10]。总体而言，极高的死亡率、晚期确诊以及现有治疗方法效果不佳等问题，都迫切需要开发更有效的疗法以及新的治疗靶点。

鉴于胰腺癌的高死亡率以及治疗效果有限，了解其关键的分子驱动因素对于研发有效的靶向疗法至关重要[11]。KRAS突变是人类癌症中最重要的致癌性变异之一，是推动肿瘤发生和发展的关键因素[12]。值得注意的是，KRAS突变存在于多种癌症类型中，包括胰腺癌、结直肠癌和非小细胞肺癌，这表明它具有作为广泛治疗靶点的潜力[13]。在胰腺癌中，大约90%-95%的病例存在KRAS突变，这使得KRAS成为最常见的基因突变类型，也是肿瘤发生的核心驱动因子[14][15][16]。这一突变频率远高于其他所有癌症类型——在其他癌症中，KRAS突变仅出现在约11.2%的病例中，这也凸显出胰腺癌对KRAS信号通路的极度依赖[17]。更重要的是，KRAS突变是胰腺癌发生的早期事件，在胰腺上皮内瘤变等前体病变中即可被检测到，这进一步证明了它在疾病发生和发展过程中的核心作用。

在胰腺癌中，绝大多数KRAS突变发生在第12密码子位置，约占所有KRAS突变的84%[18]。其中，G12D突变最为常见，出现在34%-49%的病例中；其次是G12V突变，出现在28%-34%的肿瘤中[18][19][20][21]。与之相反，G12C突变在胰腺癌中极为罕见，仅出现在1%-3%的病例中，这一分布与肺腺癌有很大差异——在肺腺癌中G12C突变更为普遍[22][23][24]。这种组织特异性突变模式对治疗方案的开发和临床应用有着重要意义。

从功能上来看，KRAS蛋白是一种小型GTP酶，它可以在无活性的GDP结合状态和有活性的GTP结合状态之间转换，从而调控MAPK/ERK、PI3K/AKT等关键信号通路，这些通路负责控制细胞的增殖、存活和代谢过程[25][26][27]。第12密码子的突变会阻碍KRAS蛋白自身的GTP水解功能，使其始终处于活跃状态，进而持续引发下游信号传导，促进肿瘤的生长、侵袭和转移[20]。值得注意的是，不同的KRAS突变具有不同的生化特性：G12C突变型的KRAS蛋白仍保留相对较高的GTP酶活性，而G12D和G12V突变型的活性则逐渐降低，这就导致了不同突变型在信号传导方面的差异，以及相应的治疗敏感性差异[20]。

尽管KRAS已被确认为重要的致癌驱动因子，但长期以来直接对其实施药物抑制一直面临很大挑战，因此它曾被归类为“难以用药治疗的靶点”。后来，人们成功开发出了针对KRAS G12C突变型的共价抑制剂，其中Adagrasib成为首个获得美国食品药品监督管理局批准的此类药物，它的临床疗效证明了KRAS确实是可以作为药物靶点的[18][28][29]。然而，由于KRAS G12C突变在胰腺癌中的发生率仅为1%-3%，Adagrasib在胰腺癌治疗中的应用范围十分有限，只能用于一小部分患者[22][29][30]。

相比之下，KRAS G12D和G12V突变在胰腺癌中极为常见，这也就意味着存在巨大的未满足的治疗需求。MRTX1133是一种选择性抑制KRAS G12D突变的药物，而RMC-6236（Daraxonrasib）则是一种可同时抑制G12V突变型和野生型KRAS蛋白的广谱KRAS抑制剂，它们是目前针对这类突变型最先进的参考药物[31][32]。在本研究中，这些经过临床和临床前试验验证的KRAS抑制剂被用作参考配体，用以评估所设计的新型抑制剂与野生型及各种突变型KRAS蛋白的结合亲和力、稳定性以及动态行为[33]。尽管已有这些进展，但目前针对不同突变型的专用药物仍然十分有限，而且由于信号通路的重新激活和代偿性信号传导，针对KRAS的疗法往往容易产生耐药性。因此，仍有必要寻找具有更好结合特性、结构更稳定、能覆盖更多突变类型的新型抑制剂。为解决这一问题，我们对来自DrugBank数据库以及印度药用植物、植物化学与治疗学数据库（IMPPAT）的28,008种化合物进行了大规模虚拟筛选，测试它们与野生型KRAS以及G12D、G12V、G12C三种临床相关突变型KRAS蛋白的结合能力。值得一提的是，将IMPPAT数据库中的植物化学物质与DrugBank数据库中已获批及正在研发中的化合物一起纳入筛选，使得我们能够直接比较天然产物衍生物与现有KRAS抑制剂的表现。此外，本研究还结合了分子对接、药代动力学与药效学及毒性预测分析、MM-GBSA结合自由能计算、1微秒时间尺度的分子动力学模拟、主成分分析、聚类分析以及密度泛函理论计算，最终筛选出了可能对胰腺癌治疗具有应用价值的、针对特定突变型或多种突变型的KRAS抑制剂。

片段1：虚拟筛选与分子对接评估
我们从蛋白质数据银行中获取了野生型及各种突变型KRAS蛋白的晶体结构。KRAS G12C蛋白的结构（PDB编号：6OIM）的分辨率达到1.65埃，该结构中包含GDP分子、一个Mg2+离子以及共结晶的配体id MOV（AMG 510）[34]。在进行分子对接之前，我们先去除了共结晶的配体，但保留了GDP和Mg2+，以此维持KRAS蛋白原本的核苷酸结合构象。KRAS G12D蛋白的结构（PDB编号：5US4，分辨率1.83埃）、KRAS G12V蛋白的结构（PDB编号：7C40，分辨率2.52埃）以及野生型KRAS蛋白的结构也分别被用于后续分析。

片段2：通过分子对接筛选并验证针对KRAS突变型的候选配体
我们使用AutoDock Vina软件对野生型KRAS蛋白以及G12D、G12V、G12C三种突变型KRAS蛋白进行了基于结构的虚拟筛选，随后又用AutoDock4软件对排名靠前的候选配体进行了重新评估，以确保其结合姿态的合理性以及排序结果的可靠性。我们还将这些候选配体与已有的针对特定突变型且经过临床研究的抑制剂进行了对比，这些抑制剂包括用于抑制G12D突变的MRTX1133、用于抑制G12V突变型和野生型KRAS蛋白的Daraxonrasib，此外还加入了Sotorasib作为另一种对比药物。分子对接的结果……

讨论
在各种KRAS突变型中，我们可以观察到一些共同的机制特征。在G12D突变型中，静电互补作用以及Switch I结构的相互作用起着主导作用；而在G12V突变型中，疏水口袋的适配以及蛋白环结构的稳定作用则更为显著。G12C突变型的稳定机制则与Switch II结构以及Cys12/Lys88位置的相互作用有关，而野生型KRAS蛋白的结合机制则主要由典型的Switch界面接触决定。氢键的稳定性以及氢键网络的整体密度，都与蛋白口袋的适配情况以及特定氨基酸残基的作用密切相关。

结论
本研究采用综合性的计算机模拟方法，结合分子对接、分子动力学模拟、MM-GBSA结合自由能计算、聚类分析、密度泛函理论分析以及药代动力学与药效学分析，对潜在的野生型及各种突变型KRAS蛋白抑制剂进行了评估。研究结果表明，不同突变型存在特定的稳定机制：吡布特罗和莱沃诺尔德弗林通过与Asp12位置的静电相互作用以及Switch I结构的结合，实现了对G12D突变型KRAS蛋白的最佳结合；伊里林D和莱沃诺尔德弗林则有助于稳定G12V突变型KRAS蛋白……

Credit作者贡献说明
苏迪尔·库马尔·卡塔里：实验验证、研究指导、资源提供、数据分析、概念设计。赫曼塔·马尼·库马尔·查克拉瓦蒂·钱达：文章撰写与修改、初稿编写、数据可视化、软件使用、研究方法设计、实验执行、数据分析。

利益冲突声明
作者声明不存在任何利益冲突。

数据可用性说明
本研究所生成和/或分析的所有数据，可在合理请求下从相应作者处获取。

资金支持声明
作者声明，在本研究的开展、论文写作以及发表过程中，没有接受任何形式的财务资助。

竞争性利益声明
作者声明不存在任何竞争性利益。

致谢
1. 作者们衷心感谢VFSTR机构（被视作大学性质）提供的师资启动基金（编号为VFSTR/REG/A6/30/2023-24/01，发放日期为2023年5月16日），该基金为我们的研究提供了重要支持。
2. 作者们还感谢使用了包括ChatGPT（OpenAI）和Gemini（Google）在内的人工智能工具来辅助语言编辑和句子优化。这些工具仅用于提升手稿的清晰度和语法水平，未曾用于生成科学内容、进行分析、撰写技术性文本或进行解读工作。