综述：三维细胞培养技术与光生物调节整合用于支持脂肪干细胞向平滑肌分化

《Cell Biochemistry and Function》：Integration of Three-Dimensional Cell Culture Techniques and Photobiomodulation for Supportive Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells into Smooth Muscle

　　

光生物调节（PBM）已被公认为一种有前景的非侵入性策略，可用于增强脂肪干细胞（ADSCs）向平滑肌细胞（SMCs）的分化，特别是与三维（3D）水凝胶培养系统结合使用时。本综述探讨了PBM调节细胞行为的关键机制，以及其在促进ADSCs向SMCs谱系定向分化中的作用。研究人员研究了不同光参数（包括波长、强度、能量密度、暴露时间和持续时间）对细胞反应（如增殖、代谢活性、基因表达和功能成熟）的影响。此外，研究人员还仔细分析了不同的水凝胶支架及其组成，以及它们对PBM功效和相应细胞结果的影响。研究人员还强调了支架设计在模拟天然细胞外基质（ECM）方面的重要性，以及支架如何与某些机械信号一起在支持干细胞行为中发挥关键作用。通过识别当前挑战、文献空白并提出未来建议，本综述旨在为优化PBM方案以改善ADSCs的SMCs分化提供见解，最终目标是将PBM整合到优化再生疗法中，用于血管疾病及其他平滑肌相关疾病的再生医学和组织工程（TE）策略。

论文主体部分总结如下：

**1 引言**

平滑肌是一种不随意、非横纹肌，受自主神经系统神经支配。其收缩功能对于血管生成、中空器官功能调节和血压维持至关重要。然而，炎症、氧化应激、去分化和细胞外基质（ECM）重塑紊乱会导致平滑肌细胞（SMCs）结构与功能改变，最终影响其所处器官。因此，对用于替代疗法的SMCs需求增加。SMCs在再生医学中的应用之一是血管组织工程（TE），其中人工血管的开发依赖于SMCs的功能整合。尽管取得进展，但功能稳定SMCs的生成和来源仍是TE的主要挑战。从组织中分离的细胞常表现出增殖能力降低和体外收缩表型丧失，而从病变组织获得的细胞可能保留病理特征。为规避这些挑战，研究人员探索了脂肪干细胞（ADSCs）作为替代细胞来源。ADSCs是一类存在于脂肪组织基质血管部分的间充质干细胞（MSCs），因其丰富性、易获取性和低供体部位发病率而受到广泛关注。它们具有显著的分化和再生潜力，可分化为多种细胞类型，包括脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞和SMCs，适用于组织修复、再生以及中空器官和血管的工程化。尽管ADSCs在平滑肌再生方面显示出巨大前景，但仅凭传统生化诱导方法可能无法完全复制有效谱系定型所需的复杂信号环境，因为干细胞分化受生化、机械和微环境信号共同调控，而非仅可溶性因子。因此，能够调节细胞行为并增强分化结果的辅助策略日益受到关注。光生物调节（PBM）作为一种此类策略出现，因其能够调节细胞代谢、增殖、基因表达和组织再生。PBM利用低水平激光疗法（红色或红外光），功率输出低于其他激光治疗方法，因此由于缺乏热效应而对细胞无害，同时刺激有利于细胞代谢过程的热光化学反应。虽然PBM已显示出增强细胞反应的潜力，但发生这些过程的微环境同样是分化结果的关键决定因素。传统二维细胞培养系统不能准确代表体内环境，细胞表现出改变的形态、增殖和分化。相比之下，三维（3D）培养系统，特别是由水膨胀聚合物网络组成的水凝胶支架，作为现代细胞培养的有前景平台出现，因为它们模拟天然ECM的关键要素，提供类似于软组织的力学特性，并支持细胞粘附和蛋白质隔离。然而，对诸如PBM等生物物理刺激策略如何与3D培养系统相互作用以影响ADSCs向SMCs分化的理解仍然有限。因此，本综述旨在批判性评估PBM在调节干细胞行为（如增殖、基因表达和分化）中的作用，审视基于水凝胶的3D系统的贡献，并探讨PBM和基于水凝胶的3D培养系统如何共同影响ADSCs分化和SMCs TE结果。

**2 PBM的潜在机制**

**2.1 线粒体刺激**：在SMCs分化中，线粒体对调节平滑肌表型和分化贡献显著。PBM主要通过刺激细胞色素c氧化酶（CCO）提供生物学效应，但也可能与其他细胞靶点（如额外发色团、离子通道和膜相关受体）相互作用。PBM增强CCO活性，导致三磷酸腺苷（ATP）生成增加。这是通过光解离一氧化氮（NO）从CCO释放而促进质子梯度形成，随后驱动ATP合酶活性实现的。这些吸收峰通常出现在红光（600–700 nm）和近红外（760–940 nm）光谱区域。除调节线粒体活性外，PBM还影响活性氧（ROS）产生、NO释放和钙离子稳态，研究显示ATP水平与ADSC增殖呈正相关，表明PBM暴露后线粒体活性增强。

**2.2 ROS的生成**：研究表明，PBM由于光子吸收而诱导线粒体ROS的适度增加。此过程触发氧化还原敏感转录因子（如核因子κB (NF-κB)）的激活，该因子作为细胞氧化还原传感器。ROS产生的增加可能引发线粒体信号通路，带来细胞保护、抗氧化和抗凋亡等益处。此外，NO的光解离和释放进一步促进血管舒张、信号传导和许多重要细胞通路的激活。实验数据表明，PBM处理的ADSCs中所有波长下ROS水平均升高，并与细胞增殖增强相关。这些升高的ROS水平并非有害，而是与增殖能力和自我更新能力增加相关，表明ROS在此发挥调节而非细胞毒性作用。

**2.3 细胞信号通路的激活**：PBM在激活对分化所需多个因子调控至关重要的信号通路方面很重要。表1总结了与SMCs分化相关的关键PBM激活信号通路，包括：丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（MAPK/ERK）通路，参与调节增殖、分化和凋亡；Wnt/β-连环蛋白通路，调节细胞命运、形态和增殖，通过抑制凋亡并增加平滑肌蛋白22α (SM22α) 表达；转化生长因子β (TGF-β) 信号通路，刺激ECM介导的胶原产生、迁移和增殖，促进成年SMCs的收缩表型并增加平滑肌α肌动蛋白 (SMαA)、calponin和平滑肌肌球蛋白重链 (SMMHC) 表达；磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B (PI3K/Akt) 通路，支持细胞存活、生长、增殖、迁移、血管生成和再生。这些通路形成相互连接的调控网络，共同调节细胞增殖、存活和平滑肌生物学过程。尽管PBM被报道可调节其中多个信号通路，但直接证据将PBM诱导的通路激活与ADSC向SMC分化联系起来仍有待探索。

**2.4 基因表达调控**：基因表达调控是SMCs分化的基础，特别是通过控制收缩表型发育的转录和表观遗传机制。组蛋白去乙酰化酶（HDACs）在染色质重塑和SMCs相关基因表达调控中发挥重要作用，从而影响SMCs谱系定型。I类HDACs的抑制与重要SMCs标志物（SMMHC、SMαA、calponin或SM22α）表达降低相关。此外，HDAC 7通过myocardin结合调节血清反应因子（SRF），促进SRF-myocardin复合物与SM22α相互作用并激活SMCs相关基因表达以驱动SMCs分化。Myocardin作为主要SRF共激活因子，负责平滑肌特异性基因的转录激活，其作用包括增强SRF促肌原活性。PI3K/Akt通路的激活与myocardin相关信号传导和分化SMCs表型的维持相关，包括调节SMαA应力纤维形成和收缩表型维持。尽管这些研究主要描述SMCs分化的一般分子机制而非直接PBM介导的基因调控，但PBM已被证明可调节与细胞增殖、线粒体活性和氧化还原信号相关的多个上游通路，因此可能间接影响与SMCs分化相关的转录程序，但精确关系尚不完全清楚。

**2.5 影响PBM效率的参数**：PBM效率受多个关键参数影响。表2总结了这些参数及其对ADSCs向SMCs分化中PBM效率的影响，包括：波长选择（红光600–700 nm和近红外780–1100 nm增强ADSC增殖和分化）；能量密度（0.5、1、2 J/cm²影响细胞活力和增殖，5 J/cm²对有效PBM也至关重要）；生长因子（如维甲酸 (RA) 和TGF-β与PBM联合增强SMCs相关标志物表达）；共培养条件（ADSC与SMCs共培养增加增殖并增强SMC标志物表达）；细胞培养条件（培养基中葡萄糖显著影响PBM功效，血清浓度、细胞汇合度和氧水平可能影响细胞反应）；暴露时间与条件（636 nm和5 J/cm²在24–72小时增加ADSC活力和增殖，但未观察到显著SMCs分化，干细胞标志物和SMCs标志物表达随时间变化）；活性氧（生理水平ROS促进ADSC增殖和分化，PBM调节细胞内ROS产生，高水平ROS抑制自我更新）；线粒体代谢（线粒体膜电位 (MMP) 升高反映线粒体活性增强并与分化能力增加相关，PBM可增加MMP）；机械应变（机械应变与PBM和生长因子联合增强SMC分化）。

**2.6 3D水凝胶支架在PBM增强分化中的作用**：3D水凝胶作为支持框架，提供模仿天然ECM的生物模拟环境，有利于细胞存活、增殖、分化和迁移。水凝胶保留大量水分的特性为细胞活力和增殖提供了水合环境。明胶基水凝胶保持高细胞生物相容性和细胞粘附性，而含精氨酰甘氨酰天冬氨酸 (RGD) 的水凝胶增强初始附着并维持细胞形态。近期研究表明，PBM可能通过调节生物模拟微环境中的线粒体活性、ATP产生和细胞增殖进一步增强3D水凝胶系统的再生潜力。此外，水凝胶的光学和机械特性可能影响光穿透和分布，从而影响PBM效率及后续分化结果。添加ECM成分（如纤连蛋白和胶原I）的水凝胶比传统二维方法更增强ADSC分化。3D水凝胶的主要优势之一是其提供机械完整性，可3D打印以模拟组织刚度变化。

**2.7 用于ADSC干细胞分化的水凝胶类型**：用于制造水凝胶的聚合物来自天然来源（如海藻酸盐、胶原、纤维蛋白、壳聚糖、明胶和透明质酸等），因其生物相容性、环境响应性和广泛可用性而具有优势。胶原是哺乳动物组织中的ECM蛋白之一，因其生物相容性、多功能性和生物降解性而成为TE研究中的首选生物材料。合成聚合物可调节，具有可定制的机械和化学性质，但其缺点包括粘附位点有限、生物活性降低和潜在不利降解产物。聚乙二醇 (PEG) 是一种合成水凝胶，其性质取决于合成条件和分子量，具有高生物相容性、成本效益和水溶性，已获得美国食品药品监督管理局 (FDA) 批准。然而，纯PEG水凝胶不能支持细胞粘附和增殖，但添加RGD肽后可促进细胞粘附，增强水凝胶性能。

**2.8 水凝胶性质对PBM功效的影响**：水凝胶性质（如组成、刚度和孔隙率）显著影响PBM功效。纤维蛋白水凝胶的不同浓度在PBM暴露后表现出不同水平的细胞活力，近红外（NIR）光在840 nm最有效。机械性质（如刚度）可通过光响应系统改变，从而影响细胞行为和机械转导途径。孔隙率是另一个重要特征，影响运输性质并决定细胞命运。多孔水凝胶改善养分和氧气扩散，对维持细胞活力和支持PBM介导的细胞活动很重要。水凝胶系统提供的光学清晰度有利于PBM光有效穿透到封装细胞中。因此，水凝胶的组成、刚度、孔隙率和清晰度是影响PBM功效的关键因素。

**2.9 水凝胶与PBM在SMCs分化中的潜在相互作用**：水凝胶和PBM的联合应用在TE中引起越来越多的兴趣，因为它们能够提供支持肌肉组织生长和分化的生物模拟机械和生化微环境。粘弹性水凝胶由于快速应力松弛特性而改善细胞增殖和分化。水凝胶提供支持细胞附着、增殖和机械转导的生物模拟三维环境，而PBM作为外部刺激调节细胞代谢和信号通路。这些因素的共同影响可能影响ADSC行为和分化，但直接证据表明水凝胶-PBM协调相互作用在ADSC衍生SMC分化过程中仍然有限。

**2.10 PBM在SMC分化中的潜在应用**：PBM显示出治疗前景，多项研究报告了与SMCs分化可能相关的分子和细胞效应。PBM在MSCs和ADSCs中报告的效果包括增强增殖、迁移和分化相关反应，但直接评估SMCs特异性标志物（如SMαA和SMMHC）的研究仍然有限。此外，PBM具有抗炎和再生效应，包括调节炎症反应和刺激与组织修复过程相关的促血管生成和促肌原因子。这些发现提供了间接证据，表明PBM可能影响与SMCs分化相关的通路，但仍需进一步研究直接评估SMCs相关标志物表达和最佳PBM参数。

**2.11 未来方向的挑战**：当前SMCs分化的PBM方案面临若干挑战。剂量依赖性效应影响PBM功效，因为其高度依赖于所选参数（波长、能量密度、暴露时间），尤其是在3D环境中。实现最佳SMCs分化结果需要确定不引起不良效应的PBM参数。此外，低效且不一致的分化方案导致不同细胞系间变异性增加且分化效率低。另一个显著挑战是控制合成表型与收缩表型之间的转换。合成型SMCs倾向于增殖和ECM产生，而收缩表型对功能性脉管系统是必需的。PBM影响细胞活性，但其在3D水凝胶基质中对ADSCs的作用以及在SMCs分化过程中的确切分子和细胞机制尚未完全了解。同样，水凝胶的多样性质（组成、刚度、降解速率）及其对PBM处理下ADSC行为的影响也未很好阐明。最后，尽管进行了大量研究，但关于PBM应用于SMCs分化的全面临床指南仍然缺乏。克服这些限制需要努力标准化PBM参数、提高有效且一致的方案、加深对潜在机制的理解以及建立基于证据的临床指南。

**3 结论**

ADSC、PBM和3D水凝胶支架的融合为再生医学和TE提供了一个有前景的方法，特别是在SMCs分化方面。本综述强调了PBM的潜力和临床转化面临的挑战。ADSCs作为MSCs来源具有优势，因为它们丰富且易于获取，同时仍能分泌细胞因子和生长因子等生物活性成分。PBM已被证明可调节细胞机制，包括线粒体活性、ROS产生以及MAPK/ERK、Wnt/β-连环蛋白和TGF-β等信号通路。PBM是否直接调节ADSC向SMC分化过程中的这些转录网络仍有待确定。PBM的无创性及其调控基因表达和细胞代谢活动的能力增强了其治疗潜力。3D水凝胶通过提供密切复制ECM的生物模拟环境，在实现分化中发挥重要作用，从而促进活力、增殖和分化。尽管存在大量研究强调PBM和水凝胶各自的益处及其在ADSC向SMCs谱系分化中的贡献，但关于两者协同效应或其潜力的现有文献非常有限。PBM对ROS水平、线粒体活性和炎症反应的调节补充了水凝胶提供的机械和生化信号。为实现这一目标可能遇到的挑战包括缺乏标准化的PBM方案以优化参数；对于水凝胶，需要微调某些性质以促进与PBM的有效协同。此外，确保SMCs合成表型与收缩表型之间的平衡过渡对于功能性至关重要，但仍是一个明显的障碍。最后，ADSC、PBM和3D水凝胶支架的整合方法提供了一种克服当前SMCs分化和TE中现有限制的手段，为治疗SMCs相关疾病提供了新的解决方案。未来建议包括通过重点研究和优化解决现有挑战，以及评估分化SMCs在体内的长期稳定性和功能性，这将拓宽临床应用尤其是再生医学的道路，从而改善患者预后。