前扣带回皮质神经元亚型对癫痫发作的差异性调控

《Epilepsia》：Anterior cingulate cortex neuron subtypes differentially regulate seizures

　　

本研究旨在探究前扣带回皮质（anterior cingulate cortex, ACC）内不同神经元亚型在急性癫痫发作中的调控作用，并鉴定该区域中参与癫痫发作调节的细胞类型特异性机制。

研究人员通过戊四氮（pentylenetetrazol, PTZ）注射建立小鼠急性癫痫发作模型。采用在体光纤光度法（in vivo fiber photometry）和微型显微镜钙成像（miniscope calcium imaging）监测神经元钙活动，同时利用多通道脑电图（electroencephalography, EEG）记录脑电信号。随后，对钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（calcium/calmodulin-dependent protein kinase II, CaMKII）兴奋性神经元、囊泡γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid, GABA）转运体（vesicular GABA transporter, vGAT）表达的GABA能中间神经元，以及小白蛋白（parvalbumin, PV）和生长抑素（somatostatin, SST）中间神经元亚群进行双向化学遗传学和光遗传学操控。

钙信号记录显示，ACC内兴奋性和抑制性神经元在急性癫痫发作期间均表现出显著的时间协调性超同步活动。抑制CaMKII神经元可显著降低癫痫发作严重程度，而其激活则可诱发自发性癫痫样活动。增强GABA能中间神经元活动可显著降低癫痫发作频率和严重程度。值得注意的是，抑制GABA能中间神经元导致明显更严重的癫痫发作。对中间神经元亚型的进一步检查揭示功能异质性；激活SST中间神经元可有效抑制癫痫发作，而PV激活未产生显著抗癫痫效果。关键的是，抑制PV或SST中间神经元均可触发自发性癫痫样活动，表明两种亚型对维持网络稳定性均为必需。

该研究阐明了ACC神经元群体在急性癫痫动态中的差异性作用。激活GABA能中间神经元或抑制CaMKII阳性神经元可有效抑制癫痫活动。在中间神经元亚型中，SST激活可减少癫痫发作，而PV激活则无此效果。然而，抑制任一亚型均可触发自发性癫痫样活动，表明两者均不可或缺，并在维持网络稳态中发挥互补作用。这些发现揭示了ACC调节急性癫痫的微环路机制，强调皮质稳定性不仅依赖于经典的兴奋-抑制平衡，还依赖于多种中间神经元亚型的协同相互作用。

癫痫是一种慢性中枢神经系统（central nervous system, CNS）疾病，由异常、过度且同步化的神经元放电引起，临床表现为反复无诱因的癫痫发作。据流行病学估计，全球约7000万人受其影响。癫痫病因高度异质，涵盖遗传性、结构性、代谢性、感染性和免疫性病因。尽管多种抗癫痫药物广泛应用于临床，但约三分之一患者仍表现为药物难治性癫痫，导致显著的伤残调整生命年减少和过早死亡风险升高，造成沉重的全球疾病负担。

正常CNS功能依赖于兴奋性与抑制性突触传递之间的动态平衡。兴奋/抑制（excitation/inhibition, E/I）平衡向过度兴奋偏移是癫痫发生和发作泛化的基本机制。已有研究阐明了特定脑区内调控该平衡的细胞基础，然而，E/I失衡的确切环路机制仍不完全清楚，尤其在特定皮质区域和神经元亚型方面。虽然海马环路已被广泛研究，但新兴证据表明皮质结构在癫痫发作的产生和传播中发挥着重要却被低估的作用。

前扣带回皮质（ACC）作为边缘系统的核心枢纽，广泛参与情绪调节、认知控制和疼痛处理等高级脑功能。重要的是，ACC与关键致痫区域广泛连接，提示其在癫痫发作调控中的作用。临床证据进一步支持其参与癫痫网络：神经影像学研究显示遗传性全面性癫痫患者ACC存在显著灰质体积减少；功能磁共振成像和颅内EEG数据表明，ACC与内侧前额叶皮质的网络活动与癫痫发作期间意识障碍密切相关。在分子水平上，ACC投射神经元中谷氨酸离子型受体红藻氨酸盐型亚基1的异常表达可诱导癫痫样活动。尽管ACC参与癫痫及其共病，但局部E/I动态的具体贡献仍不明确，特别是这些微环路中兴奋性与抑制性神经元的相互作用如何调节癫痫发作尚不清楚。

研究人员利用PTZ诱导的小鼠急性癫痫发作模型，整合行为学分析、在体光纤光度法钙成像、EEG以及化学遗传学和光遗传学方法，研究了ACC兴奋性和抑制性神经元在急性癫痫调节中的作用，并进一步解析了GABA能中间神经元亚型的贡献。该研究旨在揭示ACC调节急性癫痫的微环路机制，为理解皮质节点在癫痫网络中的作用提供新证据。

该研究采用的关键技术方法包括：（1）PTZ腹腔注射（60 mg/kg）建立小鼠急性癫痫发作模型，采用改良Racine量表进行行为学评分；（2）在体光纤光度法记录群体钙信号，使用470 nm LED激发GCaMP6s，以ΔF/F₀ = (F ? F₀)/F₀ × 100%计算荧光变化；（3）微型显微镜（nVista HD, Inscopix）在体单 Neuroscience钙成像，利用主成分分析-独立成分分析算法提取神经元活动；（4）多通道EEG记录（2000 Hz采样率，1–100 Hz带通滤波，50 Hz陷波），计算功率谱密度；（5）化学遗传学操控：CNO（5 mg/kg）激活hM3D(Gq)或抑制hM4D(Gi)DREADDs（designer receptors exclusively activated by designer drugs， designer受体 exclusively activated by designer drugs）受体；（6）光遗传学操控：eNpHR3.0采用594 nm黄光（10 mW，连续模式），ChR2采用473 nm蓝光（8 mW，脉冲模式，20 Hz，5 ms脉宽）；（7）采用CaMKII-Cre、Vgat-Cre、SST-Cre、PV-Cre及Gad67-GFP转基因小鼠进行细胞类型特异性研究。样本队列来源于Genepax Biotechnology Co.提供的雄性野生型C57BL/6J小鼠及各转基因小鼠（6–8周龄，22–24 g）。

PTZ诱导小鼠产生 robust 的行为学和电生理学癫痫发作：研究人员通过行为学评分和EEG记录评估了PTZ诱导的急性癫痫发作。PTZ组表现出特征性癫痫行为，按改良Racine量表从面部抽搐进展至肢体阵挛再到全身性强直-阵挛发作；脑电图显示皮质高同步放电，以重复性高幅尖慢波复合波和多棘波爆发为特征，δ、θ、α、β和γ频段绝对功率均显著升高；行为学评估确认PTZ组癫痫发作阶段显著升高，每只PTZ处理小鼠均经历至少一次全面性强直-阵挛发作（generalized seizure, GS）。

ACC兴奋性和抑制性神经元在癫痫发作期间广泛激活：免疫荧光显示，PTZ诱导的癫痫发作后ACC中c-Fos阳性细胞显著增加。c-Fos与CaMKII神经元的共定位率在PTZ组显著高于对照组。抑制性神经元同样显著激活，PTZ组c-Fos与Gad67的共定位率显著升高。PV和SST神经元分别占Gad67阳性细胞的43.8%和38.3%，两种亚型在PTZ注射后均显示c-Fos诱导显著升高。这些发现表明PTZ诱导的癫痫发作触发ACC神经元的广泛激活。

ACC CaMKII神经元双向调节癫痫样活动：为追踪ACC兴奋性神经元在癫痫发作期间的群体动态，研究人员使用光纤光度法记录CaMKII神经元的钙信号。热图显示PTZ诱导的癫痫发作期间钙瞬变显著增强，信号在发作开始后0–0.5秒内激增，随后于0.5–1秒内降至基线以下。在体微型显微镜钙成像显示，虽然大多数神经元在基线期相对静默，但PTZ诱导的癫痫发作激发了成像视野内同步化的高幅钙反应；代表性单神经元轨迹确认钙瞬变频率和幅度均大幅增加，多个神经元在癫痫发作窗口内显示近同步活动，同步性指数（平均成对Pearson相关系数）在发作期相对于基线显著升高。

为验证因果关系，研究人员向CaMKII-Cre小鼠ACC双侧注射Cre依赖性hM4D(Gi)载体。时频EEG分析显示，化学遗传学抑制显著削弱病理爆发；行为学分析确认hM4D(Gi)组癫痫发作阶段降低、GS发作次数减少、EEG癫痫发作起始和GS潜伏期延长。光遗传学抑制通过eNpHR3.0产生类似抗癫痫效果。反之，为检验ACC CaMKII神经元激活是否足以在无PTZ情况下诱导癫痫样活动，研究人员在该群体表达hM3D(Gq)；EEG记录显示CNO给药触发阵发性棘波放电，时频分析揭示间歇性高频功率升高与阵挛行为重合，hM3D(Gq)表达小鼠表现出自发性癫痫发作、GS频率增加以及EEG癫痫发作起始和GS潜伏期缩短。该致痫效应经CNO与PTZ联合给药进一步验证。选择性消融ACC CaMKII神经元同样降低癫痫发作阶段、减少GS频率并延长癫痫发作潜伏期。这些发现证明ACC CaMKII神经元双向调节癫痫易感性和严重程度。

ACC GABA能神经元双向调节癫痫样活动：研究人员在Vgat-Cre小鼠中使用光纤光度法监测ACC GABA能神经元活动。记录显示PTZ诱导的癫痫发作期间钙信号显著升高，发作期曲线下面积显著增加。为检验ACC GABA能神经元激活是否足以抑制PTZ诱导的急性癫痫活动，向Vgat-Cre小鼠ACC双侧注射Cre依赖性hM3D(Gq)载体。CNO激活后，hM3D(Gq)组PTZ诱导的放电幅度显著降低，所有频段功率均受抑制；GABA能神经元激活显著降低最大癫痫发作阶段和GS频率，同时显著延长EEG癫痫发作起始和GS潜伏期。PTZ挑战期间实时光遗传学激活ChR2产生一致抗癫痫效果。为探究沉默GABA能神经元对癫痫易感性的影响，使用hM4D(Gi)选择性抑制ACC Vgat神经元；CNO给药后EEG迅速转变为连续高电压强直放电，与mCherry对照相比，hM4D(Gi)表达小鼠出现自发性癫痫发作、GS频率增加、EEG癫痫发作起始和GS潜伏期显著缩短。该致痫效应在CNO与PTZ联合挑战下进一步验证。抑制GABA能神经元显著加重癫痫严重程度。这些发现证明ACC GABA能神经元对急性癫痫易感性和严重程度发挥双向调节作用。

SST中间神经元激活而非PV中间神经元激活有效减轻癫痫发作：鉴于全局GABA能激活的抗癫痫效果，研究人员进一步研究了PV和SST中间神经元对ACC急性癫痫调节的特异性贡献。首先在PV-Cre小鼠ACC双侧表达hM3D(Gq)。CNO激活后，hM3D(Gq)组仍表现出高幅连续尖慢波放电和功率增强，与mCherry对照相当；虽然PV激活显示数值上的癫痫抑制趋势，但最大癫痫发作阶段、GS频率和癫痫发作起始潜伏期的差异无统计学意义。当将相同策略应用于SST-Cre小鼠激活SST中间神经元时，SST-hM3D(Gq)组显示振幅降低，时频图揭示高频功率减弱；激活SST中间神经元降低最大癫痫发作阶段和GS频率，同时延长EEG癫痫发作起始和GS潜伏期。激活SST中间神经元足以抑制过度兴奋；然而，在PTZ诱导的去抑制条件下，PV中间神经元激活未能产生可比较的抗癫痫效果。

SST和PV神经元的基础活动对维持ACC网络稳态均为必需：为研究这些亚型的作用，向PV-Cre和SST-Cre小鼠ACC注射Cre依赖性hM4D(Gi)进行选择性化学遗传学抑制。在CNO条件下，抑制PV或SST神经元均诱发阵发性尖慢波和癫痫样放电伴高功率波动。与对照相比，PV和SST抑制均显著提升癫痫严重程度并缩短EEG癫痫发作起始潜伏期。与PTZ刺激联合时，抑制PV或SST中间神经元均未显著改变最大癫痫发作等级或总GS频率，但两者均显著缩短EEG癫痫发作起始时间和GS潜伏期。因此，尽管激活效果不同，两种中间神经元群体均为防止网络过度兴奋和共同调节皮质抑制性紧张所必需。

在讨论部分，研究人员指出全面性癫痫发作源于大规模脑网络中的异常重组。ACC虽与边缘结构、丘脑核团和新皮质区域广泛连接，但其参与癫痫传播的特异性门控机制此前尚不清楚。该研究采用多模态记录结合细胞类型特异性操控，系统解析了不同ACC神经元群体对PTZ诱导小鼠急性癫痫活动的贡献。结果证实CaMKII神经元和GABA能中间神经元发挥相反的功能作用：抑制CaMKII神经活动或增强GABA能传递减轻PTZ诱导的癫痫发作，而反向操控则诱发原本 naive 小鼠的癫痫样活动。此外，GABA能亚型内存在功能异质性：SST阳性中间神经元的化学遗传学激活产生显著抗惊厥效果，而PV阳性中间神经元激活未产生显著效果；然而，抑制任一亚型均加重癫痫严重程度。这些数据确立ACC网络稳定性并非依赖于简单的线性兴奋-抑制平衡，而是依赖于SST和PV中间神经元发挥不同 yet 互补作用的非对称性、亚型特异性调节机制。

研究人员特别指出，由于PTZ通过系统性去抑制而非局灶性起始诱导癫痫发作，该研究证明ACC神经元活动参与调节急性癫痫的发作表现，但并未将ACC鉴定为主要癫痫发作起始区。GABA能抑制引发的癫痫活动与CaMKII神经元直接激活引发的癫痫活动相比，显示更短潜伏期和更严重强直期，这种差异可能反映稳态反馈环路的不同参与程度。在基线条件下，皮质网络严重依赖负反馈维持稳定性；当兴奋性输出人为升高时，局部微环路可迅速动员补偿性抑制以部分抵消兴奋性扰动，而靶向消融GABA能功能则 dismantle 核心反馈架构，使网络深度去抑制，即使生理性输入也可触发失控性兴奋。

关于不同中间神经元亚型的差异性效应，SST神经元主要支配锥体神经元远端树突，而PV神经元主要靶向胞体和轴突始段；在PTZ诱导的强烈且空间广泛的兴奋性驱动下，SST神经元的树突抑制可能更有效地限制兴奋性输入整合，从而提高放电阈值。此外，SST神经元显示弱频率适应性，其输出突触具有短程易化特性，而PV中间神经元在极端病理条件下易发生去极化阻滞。在网络受PTZ强烈驱动时，显著的胞体饱和可能通过天花板效应掩盖PV神经元激活的抗癫痫效果。PV介导的胞周体抑制限制初始锥体细胞爆发，而SST知觉的树突抑制限制下游兴奋传播，因此激活结果可能反映急性全局去抑制期间不同的基线募集阈值，而非证明SST神经元在控制癫痫方面独特优越。

研究人员强调，协同性中间神经元网络是维持稳态的核心，因为抑制GABA能细胞比激活兴奋性神经元导致更严重的急性癫痫样活动。虽然选择性激活SST神经元抑制PTZ诱发的癫痫发作，但PV和SST群体均为调节皮质兴奋性所必需，因此调控这些亚型为探索ACC环路在更广泛神经调控研究中的应用提供了依据。

研究局限性包括：急性PTZ模型依赖于系统性去抑制，不能模拟自发性局灶性癫痫发作或慢性癫痫发生；虽然各种ACC群体参与调节这些急性事件，但研究发现并未确立该区域为主要癫痫发作起始灶。未来需结合慢性癫痫模型和同步多区域记录以精确界定ACC的功能层级。

研究结论：该研究证明，通过激活ACC内GABA能中间神经元或抑制CaMKII神经元可抑制癫痫发作。虽然激活SST而非PV中间神经元足以抑制癫痫发作，但抑制任一亚型均可触发癫痫样放电，表明两者通过互补作用共同贡献于癫痫控制。这些结果揭示了ACC神经元对急性癫痫调节的细胞类型特异性贡献。