综述：神经类器官模型作为研究肌萎缩侧索硬化症疾病机制的平台

《Journal of Neurochemistry》：Neural Organoid Models as a Platform for Studying Disease Mechanisms in Amyotrophic Lateral Sclerosis

　　

肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic lateral sclerosis, ALS）是一种致命性的神经退行性疾病，影响上、下运动神经元，导致肌肉萎缩。然而，包括皮质变薄和TDP-43（TAR DNA-binding protein 43）病理在内的结构和分子异常已延伸至额叶、顶叶和颞叶区域，指向更广泛皮质区域的缺陷。人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cell, hiPSC）技术的出现使得在体外产生人源特异性的脑细胞类型成为可能。在此，研究人员概述了用于模拟皮质结构并研究皮质型ALS相关表型的、源自hiPSC的三维（three-dimensional, 3D）神经类器官平台。研究人员回顾了这些类器官中已重现的病理标志，并讨论了迄今为止报道的疾病表型。此外，研究人员全面涵盖了不同的神经类器官模型和实验策略，包括患者来源的hiPSC模型和外源性病理诱导，同时讨论了当前的技术挑战。综上所述，这些进展将神经类器官定位为一种新兴工具，用于研究与ALS中皮质变化相关的细胞类型特异性和环路层面的机制。

肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic lateral sclerosis, ALS）是一种成人发病且快速进展的神经退行性疾病，其特征是脊髓和脑干的下运动神经元以及运动皮质的上运动神经元进行性丧失。大约10%的患者有明确的家族史，超过30个相关基因已被鉴定。虽然其余90%被认为是散发性的，但ALS是一种遗传度估计为40%–50%的复杂疾病。最常见的ALS关联基因，如C9ORF72（chromosome 9 open reading frame 72）、SOD1（superoxide dismutase 1）、TARDBP（TAR DNA-binding protein）和FUS（fused in sarcoma），其致病性变异约占家族性病例的60%和散发性ALS的约10%。ALS不仅在遗传上复杂，而且在临床上是一种异质性疾病，与额颞叶痴呆（frontotemporal dementia, FTD）共享病理生物学特征。C9ORF72中非编码六核苷酸重复扩增（hexanucleotide repeat expansions, HRE）的发现，证明这些疾病是单一疾病表型谱上的极端表现。ALS的发病机制尚不完全清楚，但特定遗传亚型特有的基因缺陷汇聚于一组共同的细胞和分子通路，包括RNA代谢异常、毒性蛋白聚集、线粒体功能障碍、蛋白质稳态和自噬失败、细胞骨架蛋白、氧化应激和神经炎症。

在ALS关联基因概述中，TDP-43蛋白的细胞质聚集体存在于几乎所有ALS患者中，是该疾病的核心病理标志。TDP-43是一种主要定位于细胞核的RNA/DNA结合蛋白，其病理涉及核清除导致的“功能丧失”（loss-of-function, LoF），以及细胞质错误定位后的过度磷酸化和裂解。磷酸化TDP-43（phosphorylated TDP-43, pTDP-43）包涵体在ALS中首先出现于运动皮质的投射神经元，并在后期广泛进展至颞叶、内嗅皮质和海马。C9ORF72基因第一个内含子区中的六核苷酸（G₄C₂）重复扩增是ALS最常见的遗传原因，其致病机制包括形成隔离RNA结合蛋白的核内RNA foci（RNA foci）、重复序列相关的非AUG（repeat associated non-AUG, RAN）翻译产生二肽重复蛋白（dipeptide repeat proteins, DPRs），以及重复序列高甲基化导致的C9ORF72单倍剂量不足。SOD1是一种高度保守的铜锌超氧化物歧化酶，其致病性变异约占全球ALS病例的1%–6%，突变SOD1通过多种通路诱导神经元死亡，被认为主要引起毒性“功能获得”（gain-of-function, GoF）效应。FUS是一种RNA结合蛋白，疾病相关变异主要聚集在其核定位信号（nuclear localization signal, NLS）区域，导致其在上下运动神经元中形成胞质包涵体。

越来越多的影像学、神经病理学和临床证据表明，ALS并不局限于运动神经元，初级皮质之外的多个皮质和皮质下区域表现出结构和分子病理，如TDP-43病理、皮质变薄和选择性神经元脆弱性。大规模单核RNA测序研究报道了在散发性和家族性ALS及FTD病例的运动皮质和背外侧前额叶皮质中存在趋同的细胞类型特异性基因表达变化，这有助于解释ALS-FTD谱系中常见的认知和行为改变。这一广泛皮质受累表明ALS通过大规模皮质网络进展，因此需要能更准确地重现人皮质生物学和环路动力学的实验模型。

hiPSC可被分化为二维（2D）培养物或三维（3D）类器官模型。hiPSC衍生的神经类器官可通过指导性或非指导性方法生成。指导性分化产生区域特异性的神经类器官，如皮质类器官，其重现了人皮质发生的关键特征，包括放射状胶质细胞样细胞的自组织以及深层和上层皮质神经元的顺序生成。非指导性分化则产生包含多个神经系统区域神经群体的异质性类器官，也称为全脑类器官。在皮质类器官的基础上，进一步发展出气液界面皮质类器官（air-liquid interface cortical organoids, ALI-COs），其通过将类器官切片并在气液界面培养，改善了组织氧合，促进了神经元长期存活和轴突生长。嵌合体类器官则通过模块化、重新聚集的方法，将来自不同个体的前体细胞组合到单个类器官中，为研究遗传变异如何影响疾病易感性提供了平台。除了皮质，脊髓类器官能重现人类脊髓发育，包含背侧感觉神经元和腹侧运动神经元等，为研究ALS中下运动神经元脆弱性提供了系统。此外，组装体通过融合并功能性整合两个或多个区域特异的类器官，能够在体外重建多区室神经环路，例如皮质-脊髓组装体。

在神经类器官模型中重现的ALS病理标志方面，多项研究显示，由C9ORF72-HRE hiPSC产生的皮质或全脑类器官中，存在二肽重复蛋白的积累，尤其是poly(GA)，并伴有蛋白质稳态标记物如p62的改变。在一项ALI-CO模型研究中，观察到poly(GA)大量积累，并伴有磷酸化真核起始因子2α（phospho-eukaryotic initiation factor 2 alpha, EIF2α）/EIF2α比率升高，以及应激颗粒标记物poly(A)结合蛋白1（polyA-binding protein 1, PABP1）水平升高，且p62信号在星形胶质细胞中富集。药理性抑制未折叠蛋白反应（unfolded protein response, UPR）减少了UPR活化和poly(GA)积累。此外，通过外源性“播种”方法，在来自散发性ALS-FTD患者的全脑类器官中注射C9ORF72-ALS患者脊髓提取物，可诱导出现poly(GR)重复蛋白，并与磷酸化TDP-43聚集体共定位，表明DPR病理可能传播并诱导继发性蛋白病变。神经肌肉类器官模型也证实，poly(GA)点状结构在C9ORF72-ALS的神经元和星形胶质细胞中显著升高，且在星形胶质细胞中更为明显。

TDP-43病理的改变，如过度磷酸化、核清除和细胞质错误定位，是ALS的典型神经病理学标志，但在内源性条件下很难在人皮质类器官模型中重现。然而，近期研究取得了进展。在颗粒蛋白前体（granulin, GRN）缺陷的全脑类器官样结构中，pTDP-43蛋白水平显著升高，并伴有TDP-43核外定位增加。在蛋白“播种”模型中，注射ALS患者脊髓蛋白提取物能诱导pTDP-43病理形成，并随时间加重，且pTDP-43聚集体与细胞凋亡标记物（如TUNEL和裂解的caspase-3）及DNA双链断裂标记物（γH2AX）共定位。直接模拟TARDBP突变的皮质类器官也可重现TDP-43病理，携带TDP-43-K181E突变的前脑类器官出现基因型依赖的pTDP-43增加和核TDP-43清除，且药理性抑制核输出受体Exportin 1（XPO1）可显著减少胞质pTDP-43阳性点状结构。

在RNA相关病理标志方面，TDP-43功能丧失介导的隐秘外显子（cryptic exons, CEs）包含是其致病的关键组成部分。在GRN缺陷的脑类器官样结构中，观察到STMN2的CE包含。慢性氧化应激可在C9ORF72-HRE和对照皮质类器官中触发UNC13A的CE包含和POLDIP3的剪接改变，而药理性增强自噬可减轻这些剪接缺陷。此外，C9ORF72-HRE衍生的RNA foci在多个类器官系统中被一致观察到，且不仅限于神经元，也在部分小胶质细胞中被检测到。

在ALS疾病表型研究中，类器官系统揭示了ALS相关突变如何影响人类神经发育。在FUS敲除的皮质和脊髓类器官中，神经祖细胞增殖分别出现增加和减少，并伴有神经元分化异常。C9ORF72-HRE全脑类器官则表现出早期加速生长和后期成熟受损，导致深层皮质神经元减少。在突触连接性方面，转录组分析揭示了TDP-43突变前脑类器官中兴奋性神经元的早期基因表达变化，GRN功能丧失与突触前和突触后点状结构的增加相关，而C9ORF72-HRE全脑类器官则表现出谷氨酸能突触基因表达减少、突触前点状结构变小以及自发性兴奋性突触后电流频率降低等功能缺陷。

DNA损伤和核完整性缺陷方面，暴露于ALS患者脊髓提取物的全脑类器官中，TDP-43病理与DNA双链断裂的积累相关。在C9ORF72-HRE的ALI-CO中，神经元表现出DNA损伤，且单细胞线粒体基因组分析发现星形胶质细胞中有致病性线粒体单核苷酸变异（mitochondrial single nucleotide variants, mtSNVs）的积累增加。在C9ORF72-HRE脊髓类器官中，运动神经元显示出核骨架与细胞骨架连接复合体（Linker of Nucleoskeleton and Cytoskeleton, LINC complex）的破坏，其亚基SUN1和SUN2错误定位并丰度降低。

在胶质细胞功能障碍和神经元-胶质细胞信号传导缺陷方面，含有内源性小胶质细胞的C9ORF72-ALS全脑类器官表现出与稳态、溶酶体功能和吞噬作用相关的基因网络广泛下调，以及吞噬能力降低等功能障碍，提示存在一种减弱的或适应不良的免疫反应。GRN功能丧失的星形胶质细胞则表现出吞噬通路下调和功能受损。神经肌肉类器官模型还揭示了ALS中神经肌肉接头（neuromuscular junctions, NMJ）的结构和功能缺陷，例如在携带SOD1、PFN1或TDP-43突变的类器官中，NMJ出现神经支配减少和面积缩小。C9ORF72-ALS神经肌肉类器官则表现出进行性的外周神经肌肉功能障碍，包括收缩频率降低和整合性NMJ比率下降。

在技术创新、挑战与未来方向方面，目前神经类器官仅模拟了一部分ALS致病机制，主要集中在C9ORF72-HRE和TDP-43相关机制上。C9ORF72-ALS相关的RNA foci和DPR积累常在无外界应激下自发出现，而内源性TDP-43病理则难以模拟，这反映了不同ALS亚型间根本的生物学差异。因此，遗传模型和外源性诱导模型各有侧重，分别适用于研究早期致病程序和聚集动力学。未来的技术发展需要关注增加类器官的细胞复杂性，例如增加少突胶质细胞和血管系统。开发更复杂的模型如组装体，尤其是皮质-脊髓-肌肉组装体，对于研究长程连接和环路功能障碍至关重要。多供体嵌合体类器官有望克服变异性，为研究个体间差异提供强大平台。此外，整合衰老成分对于模拟ALS这类老年发病的神经退行性疾病至关重要，最近的研究表明衰老本身就能驱动TDP-43错误定位，可通过转分化方法或添加促衰老化合物来引入。结合多电极阵列（multielectrode array, MEA）记录、钙成像和单细胞组学等技术，皮质类器官成为治疗筛选和个性化医疗的有前景的平台，有多项研究已证明药理学干预能减轻或逆转类器官中的ALS相关病理。神经类器官提供了源自患者细胞的3D平台，能模拟人脑组织中的复杂细胞相互作用，随着未来技术不断创新，它们将为疾病机制提供高度相关的见解，并为发现新的治疗机会提供平台。