利用Cas12a/ssODN非精确编辑马铃薯eIF4E1基因引入显性负调控抗性赋予对马铃薯Y病毒的抗性

《Molecular Plant Pathology》：Imprecise Cas12a/ssODN-Mediated Editing of eIF4E1 Confers Dominant-Negative Resistance to Potato Virus Y in Solanum tuberosum

　　

真核起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E, eIF4E)基因突变可提供植物病毒隐性抗性。研究人员此前发现敲除马铃薯SteIF4E1等位基因(A、B、B、B1)仅对坏死型PVY(NTN)分离物产生有限抗性。本研究采用非转基因方法，利用Cas12a与单链寡脱氧核苷酸(single-stranded oligodeoxynucleotide, ssODN)修复模板尝试将SteIF4E1编辑为模拟辣椒PVY抗性等位基因pvr21，但未获得正确编辑植株；部分突变等位基因出现截短序列重复(pvr21SD)，表明ssODN介导修复主要通过微同源介导末端连接(microhomology-mediated end joining, MMEJ)。39个编辑株系中矮化株系Bb29表现出对PVY-NTN的抗性及对PVY-O系统侵染的降低，且偶有PVY-NTN突破抗性分离物出现，证实为真eIF4E介导抗性。Bb29中四个SteIF4E1拷贝有三个发生突变(AΔ12、BΔ6、B、B1pvr21SD)，其中SteIF4E1_B1pvr21SD在突变序列5′端含提前终止密码子，StIF4E1_AΔ12为本研究编辑株系特有。酵母互补实验显示SteIF4E1_BΔ6可部分互补eIF4E缺陷酵母菌株而SteIF4E1_AΔ12不能。向Bb29转入野生型SteIF4E1可恢复病毒感性并部分逆转矮化表型；反之野生型马铃薯转入SteIF4E1_AΔ12可模拟Bb29抗性谱，且比SteIF4E1敲除方式对PVY具更强更广抗性。上述结果表明存在显性负调控(dominant-negative)抗性机制，为工程改造马铃薯Y病毒(potyvirus)抗性提供了新途径。

论文解读：利用Cas12a/ssODN非精确编辑马铃薯eIF4E1引入显性负调控抗性赋予对马铃薯Y病毒(PVY)的抗性

发表于《Molecular Plant Pathology》

研究背景与立项依据

马铃薯(Solanum tuberosum)是全球重要粮食作物，马铃薯Y病毒(Potato virus Y, PVY)为最具破坏性的马铃薯病毒之一，可致减产10%–85%，其中坏死型PVY-NTN(necrotic PVY-NTN)引起块茎坏死。传统杀虫剂无法阻断蚜虫非持久性传播，遗传抗性是最有效策略。真核翻译起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E, eIF4E)是马铃薯Y病毒属(potyvirus)侵染必需的感病(S)基因，病毒VPg蛋白通过与eIF4E互作完成侵染；eIF4E功能缺失通常产生隐性(recessive)抗性，需所有等位基因失活方有效。栽培马铃薯为四倍体，SteIF4E1有四个拷贝(A、B、B、B1)，前人CRISPR-Cas9敲除全部四个SteIF4E1拷贝才获有限PVY-NTN抗性，且双敲除eIF4E1与eIF4E2虽扩宽抗性但致发育缺陷。辣椒中天然存在的pvr2¹等位基因（含V67E和L79R替换）可赋予PVY抗性且保留部分功能。本研究试图用Cas12a配合ssODN(single-stranded oligodeoxynucleotide)单链模板修复，在马铃薯SteIF4E1中精确引入模拟pvr2¹的氨基酸替换(I70E、L82R及T76A)，探讨能否获得更强抗性，并解析编辑事件的分子机制与抗性新模式。

主要关键技术方法

以马铃薯栽培品种'Désirée'(四倍体，含SteIF4E1A、B、B1等位基因)为材料。主要技术包括：(1)Cas12a(LbCpf1)/crRNA核糖核蛋白(RNP)复合物或质粒与120 nt ssODN(含模拟pvr2¹突变及40 nt同源臂)共转染原生质体(protoplast)，再生获得编辑植株；(2)PCR初筛及Sanger测序、全长cDNA克隆测序鉴定SteIF4E1等位基因突变类型；(3)靶向扩增子高通量测序(amplicon NGS)与CRISPResso2分析编辑谱；(4)酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) eIF4E缺陷菌株JO55互补实验检测SteIF4E1野生型及突变体功能；(5)PVY-NTN(Pa36、Hu、Pa21)及PVY-O人工接种，双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)定量病毒积累评估抗性；(6)突破抗性PVY分离物VPg区测序；(7)Bb29株系农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转化回补野生型StIF4E1_A/SteIF4E1_B或空载，及野生型'Désirée'转化SteIF4E1_AΔ12验证抗性机制；(8)m⁷GTP pull-down及Western blot检测eIF4E家族蛋白积累。

研究结果

2.1 pvr2¹样突变对马铃薯eIF4E1 A和B等位基因功能影响不同

研究人员将模拟pvr2¹的三处氨基酸替换(I70E、T76A、L82R)分别引入SteIF4E1_A(SteIF4E1_Apvr2¹)和SteIF4E1_B(SteIF4E1_Bpvr2¹)，酵母互补实验显示SteIF4E1_Bpvr2¹可部分支持缺陷酵母生长但效率低于野生型，SteIF4E1_Apvr2¹完全不能互补，Western blot证实蛋白正常积累。仅引入I70E+L82R亦不能保留A等位基因功能，说明pvr2¹样突变对A、B等位基因功能影响不同，A等位基因对该区域更为敏感。

2.2 Cas12a/ssODN诱导异常的SteIF4E1等位基因

研究人员用Cas12a+ssODN编辑原生质体再生的633株植株中45株(7.1%)PCR筛查阳性。随机选16株Sanger测序均显示突变等位基因在ssODN引入突变上游出现截短序列重复(pvr2¹SD)，多为单等位基因突变；45株普遍检出慢迁移PCR片段，证实无精确ssODN整合并普遍存在微同源介导末端连接(microhomology-mediated end joining, MMEJ)导致的序列重复/重排，与RNP或质粒递送方式无关。

2.3 Bb29株系对坏死型PVY分离物具抗性且增强对PVY-O抗性

39株可生根编辑系接种PVY-NTN(Pa36、Hu、Pa21)及PVY-O，仅Bb29表现强抗性——三次独立实验中Bb29对三种NTN分离物系统侵染显著受抑(ELISA低值)；对PVY-O虽诱发局部过敏性反应(hypersensitive response, HR)同野生型，但无系统性坏死且上部叶片PVY-O积累大幅降低，表明Bb29兼具缓解PVY-O诱发系统性HR及抑制病毒系统扩展的能力。

2.4 Bb29中可出现突破PVY-Pa36抗性的分离物

高病毒接种量下Bb29少数植株后期出现感染，分离病毒VPg中心区发生点突变——株555为K105E，株554为L115S，可恢复对Bb29的感染性；接种K105E分离物使Bb29完全感病，证实抗性依赖 altered eIF4E1–VPg互作且可被VPg适应性突变克服，为首次报道PVY通过VPg进化突破马铃薯eIF4E介导抗性。

2.5 Bb29抗性株系含一个野生型及三个突变SteIF4E1等位基因

Bb29 SteIF4E1基因型为：A等位基因12 nt缺失(SteIF4E1_AΔ12，框内缺失，酵母不能互补)，一个B等位基因6 nt缺失(SteIF4E1_BΔ6，框内缺失SR，部分功能)，一个B等位基因野生型(SteIF4E1_BWT)，B1等位基因出现ssODN衍生序列重复并含提前终止密码子(SteIF4E1_B1pvr2¹SD，预计编码无Cap/VPg/eIF4G结合域截短肽，无法扩增全长说明发生重排)。Bb29仍表达功能性野生型SteIF4E1_B。

2.6 Bb29在编辑株系中具有独特基因型

靶区扩增子NGS分析39个编辑系显示各系突变模式不同，最常见为等位基因丢失(?，多因重排阻碍PCR)，其次为短缺失(Δ)；多数系编辑三个等位基因。仅Bb29含SteIF4E1_AΔ12，BΔ6与感病对照Da124相同，排除BΔ6单独致抗可能，指向SteIF4E1_AΔ12关键作用。

2.7 Cas12a介导ssODN单链模板修复的不精确性

分析各线ssODN预期SNP整合情况，仅1株(Ba13)含上下游SNP但伴序列重复，其余仅有部分SNP或无，确认植物细胞ssODN修复主要经MMEJ而非精确单链模板修复(single-strand templated repair, SSTR)，部分出现反向重复或仅5′端重复，提示ssODN被外切酶降解后通过微同源退火整合。

2.8 Bb29异位表达野生型SteIF4E1恢复PVY感性及正常生长

将野生型SteIF4E1_A或SteIF4E1_B转入Bb29，转基因株恢复PVY-Pa36敏感性至野生型水平，且株高逐渐恢复接近野生型(空载体/V对照仍为矮化)。m⁷GTP pull-down显示Bb29无可检测StIF4E1蛋白，转野生型后检出StIF4E1且eIF4E2水平受反馈调节，eIF(iso)4E水平不变，证明矮化与抗性均源自突变SteIF4E1蛋白干扰eIF4E网络。

2.9 转SteIF4E1_AΔ12植株再现Bb29抗性谱

野生型'Désirée'转入SteIF4E1_AΔ12后，对PVY-Pa36表现抗性(偶见突破分离物VPg K105E/L115S突变)，对PVY-O感染减轻且无系统性坏死，重现Bb29表型，证实SteIF4E1_AΔ12单独足以驱动显性负调控抗性。

讨论与结论总结

研究人员发现马铃薯原生质体中Cas12a/ssODN编辑SteIF4E1主要以MMEJ途径修复，产生序列重复与等位基因重排，未实现精确pvr2¹模拟 knock-in。意外获得的Bb29株系(基因型AΔ12/BΔ6/WT B/B1pvr2¹SD)保留一个功能性野生型SteIF4E1等位基因却表现出强PVY-NTN抗性、PVY-O系统侵染抑制及矮化表型——不同于经典隐性S基因抗性(需全等位基因失活)及单纯eIF4E1敲除(仅部分抗性且无矮化)。关键证据为：(1)抗性可被VPg适应性突变克服，属eIF4E介导；(2)野生型SteIF4E1回补消除抗性与矮化；(3)单独转入SteIF4E1_AΔ12(功能缺失且框内缺失)于野生型即复现抗性。表明SteIF4E1_AΔ12编码的突变蛋白以显性负调控(dominant-negative)方式干扰eIF4E1/eIF4E2–VPg互作或翻译起始复合体组装，削弱病毒利用宿主因子而不完全消除基础翻译功能(仍有一个WT等位基因表达)，从而赋予抗性并引致轻微发育表型。此为首次报道利用CRISPR/Cas产生的显性负调控感病因子(S-gene)突变赋予植物病毒抗性，拓展了基于eIF4E的抗病毒育种思路——不依赖全等位基因敲除，可通过引入特定功能干扰型突变获得potyvirus抗性，并为优化植物ssODN精确编辑及理解MMEJ主导修复提供参考。