《Movement Disorders》：High-Fat Diet Exacerbates Neuropathology in a Transgenic Mouse Model of Multiple System Atrophy
多系统萎缩（multiple system atrophy, MSA）是一种罕见且毁灭性的神经退行性疾病。越来越多的临床和临床前证据表明，糖尿病（diabetes mellitus）和胰岛素抵抗（insulin resistance）可能对MSA的病理生理学产生不利影响。研究人员旨在探究糖尿病、葡萄糖稳态失调与MSA神经病理学之间的潜在关联。研究人员将PLP-SYN（proteolipid promoter, 髓鞘蛋白脂质蛋白启动子）MSA转基因小鼠模型置于标准饲料或高脂饮食（high-fat diet, HFD）条件下喂养4个月，以诱导饮食相关的代谢改变。随后在多个时间点评估代谢、神经病理学和行为学参数。结果显示，与相同饮食条件下的野生型（wild-type, WT）小鼠相比，接受HFD喂养的PLP-SYN小鼠表现出更为明显的糖尿病表型，其特征为外周葡萄糖调节障碍加重和胰岛素抵抗加剧。此外，4个月的HFD喂养加重了MSA相关神经病理学改变，表现为α-突触核蛋白（α-synuclein, αSyn）蓄积增加和多巴胺能神经退行性变增强，同时伴随精细运动功能损害的加速。这些发现共同揭示了葡萄糖代谢紊乱与MSA神经病理学之间的关联，进一步支持了调节葡萄糖代谢以延缓MSA疾病进展的潜力，并为探索降糖药物是否具有治疗效益提供了额外的理论依据。
多系统萎缩（multiple system at MSA）是一种罕见的成年起病、散发性神经退行性疾病，以帕金森综合征（parkinsonism）、小脑功能障碍和自主神经功能障碍的不同组合为特征。其神经病理学标志是少突胶质细胞内出现α-突触核蛋白（α-synuclein, αSyn）阳性的胞质内包涵体，称为"胶质细胞质包涵体（glial cytoplasmic inclusions）"，这些包涵体在中枢神经系统（central nervous system, CNS）中广泛累积。该病呈持续进行性进展，中位生存期为6至9年。尽管目前存在一些对症治疗手段，但尚未确立能够延缓疾病进展的疾病修饰治疗。
已有少量因素被证实与MSA的发病和预后相关。其中，2型糖尿病（type-2 diabetes）在一项MSA队列研究中被发现与更差的结局相关，这提示葡萄糖代谢紊乱与MSA之间可能存在关联。类似的关联在其他神经退行性疾病中也有报道，如帕金森病（Parkinson's disease, PD）和阿尔茨海默病（Alzheimer's disease）。此外，横断面研究表明MSA患者中糖尿病和降糖药物的使用率更高。
异常葡萄糖代谢包括胰岛素抵抗，定义为目标组织对胰岛素和胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor-1, IGF-1）信号的反应性降低。多项研究提示MSA患者存在胰岛素信号改变，包括血清胰岛素和IGF-1浓度升高。特别是，血清IGF-1水平升高与症状严重程度和疾病持续时间均相关。与这些观察一致，研究人员此前在MSA患者死后脑组织中证明了中枢胰岛素抵抗的证据，表现为壳核神经元和少突胶质细胞中丝氨酸312位点磷酸化的胰岛素受体底物-1（insulin receptor substrate-1, IRS-1）即IRS-1pS312水平增加。同样，在表达人αSyn的PLP-SYN转基因小鼠（一种公认的MSA转基因小鼠模型）中检测到IRS-1pS307（IRS-1pS312的小鼠直系同源物）水平升高。在该模型中，胰高血糖素样肽-1受体激动剂（glucagon-like peptide-1 receptor agonist, GLP-1RA）艾塞那肽（exenatide）的治疗可减少神经元丢失、少突胶质细胞αSyn负荷和中枢胰岛素抵抗。
因此，研究人员探究了代谢紊乱、受损的胰岛素信号与MSA相关病理之间的潜在关系。为此，研究人员评估了经过充分描述的PLP-SYN转基因MSA小鼠模型在暴露于高脂饮食以诱导饮食相关代谢改变后的代谢和神经病理学改变程度。
**主成分分析揭示PLP-HFD小鼠的独特聚类**
在初始探索性分析中，研究人员评估了27个变量，包括2个行为学、8个代谢、13个死后组织学和4个死后生物化学变量，涵盖葡萄糖代谢、αSyn病理、神经炎症、神经退行性变和运动障碍。应用主成分分析（principal component analysis, PCA）显示，HFD喂养的PLP-SYN小鼠（PLP-HFD）沿第一主成分（PC1）聚类，PC1解释了30.4%的方差。代谢变量（体重、4个月GTT的曲线下面积（area under the curve, AUC）、4个月ITT的AUC、2个月ITT的AUC、2个月GTT的AUC、脂肪重量、空腹血糖）、αSyn相关变量（黑质MJFR1表面积、纹状体MJFR1表面积、黑质PK抵抗性pSyn）以及神经退行性变相关变量（黑质TH强度、黑质TH表面积、黑质TH数量）是PC1的主要贡献因素。这些结果表明PLP-HFD队列呈现出与特定代谢和神经病理学特征相关的独特表型。
**PLP-HFD小鼠表现出外周葡萄糖耐量受损**
在体研究阶段，研究人员在不同时间点评估了多项代谢变量。与预期一致，WT-HFD和PLP-HFD小鼠与SD喂养的WT（WT-SD）和PLP-SYN（PLP-SD）小鼠相比体重更高。值得注意的是，PLP-HFD小鼠在4个月饮食后的平均体重显著高于WT-HFD小鼠。4个月饮食后，PLP-HFD小鼠还表现出比PLP-SD和WT-SD小鼠更高的空腹血糖。此外，PLP-HFD小鼠具有更高的附睾脂肪质量，这是肥胖的公认可靠指标。
在T0（饮食开始前），WT和PLP-SYN小鼠之间无显著差异，表明两组在基线水平对葡萄糖 administration 的耐受性相似。在T0+2个月和T0+4个月，研究人员观察到WT-HFD和PLP-HFD小鼠在葡萄糖耐量试验（glucose tolerance test, GTT）中的血糖水平高于其SD同窝小鼠。此外，PLP-HFD小鼠在4个月饮食后表现出比WT-HFD小鼠更严重的葡萄糖不耐受，在T0+2个月时已观察到类似趋势。
这些数据表明HFD小鼠表现出葡萄糖代谢受损，其中PLP-HFD小鼠相比所有其他组表现出最为明显的代谢功能障碍。
**PLP-HFD小鼠表现出外周胰岛素抵抗和脑胰岛素敏感性受损**
为评估PLP-HFD小鼠是否存在外周胰岛素抵抗，研究人员在T0+2个月和T0+4个月进行了胰岛素耐量试验（insulin tolerance test, ITT）。在T0+2个月，仅PLP-HFD组呈现出血糖下降幅度较小的现象，与WT-SD和PLP-SD组相比。在T0+4个月，WT-HFD和PLP-HFD在胰岛素 administration 后均表现出比其SD同窝小鼠更高的血糖水平。值得注意的是，PLP-HFD队列表现出比WT-HFD小鼠更严重的胰岛素不耐受趋势，提示PLP-SYN小鼠比WT小鼠更具胰岛素抵抗性。
为评估四组实验动物的脑胰岛素敏感性，研究人员采用急性鼻内胰岛素挑战后的旷场试验来评估焦虑状态。研究人员在16小时禁食动物中进行鼻内胰岛素或生理盐水 administration ，1小时后进行旷场试验，测量在中央区域的时间。研究观察到WT-SD组在中央区域时间有下降趋势，提示如预期那样胰岛素具有抗焦虑特性。相反，所有其他测试组在中央区域时间均无变化，提示PLP-SD和PLP-HFD小鼠存在脑胰岛素抵抗。
处死后，研究人员通过分析外周组织（肝脏）和不同脑区（额叶皮层、纹状体和黑质）中IRS-1pSer307与总IRS-1水平的比值来评估胰岛素抵抗的生物化学标志物。在肝脏中，四组实验动物之间未观察到IRS-1pSer307与总IRS-1水平的显著差异。在脑中，额叶皮层和纹状体各实验组之间也未观察到IRS-1pSer307与总IRS-1比值的显著差异。然而，在黑质中，研究人员观察到PLP小鼠相比WT小鼠IRS-1pSer307/总IRS1水平增加，提示该区域的胰岛素抵抗。但是，PLP-SD和PLP-HFD小鼠之间未观察到差异。
这些数据提示HFD喂养小鼠表现出外周胰岛素抵抗和轻度脑胰岛素敏感性受损，以及异常的葡萄糖耐量，其中PLP-HFD小鼠表现更为明显。
**PLP-HFD小鼠α-突触核蛋白病理增加**
为确定葡萄糖代谢紊乱对MSA病理的影响，研究人员检查了WT和PLP-SYN小鼠SD或HFD喂养4个月后的死后脑中不同αSyn病理标志物。由于PLP-SYN小鼠特异性地在少突胶质细胞启动子（PLP启动子）下过表达人SNCA基因，研究人员首先评估了黑质和纹状体中人αSyn阳性少突胶质细胞的百分比。观察到PLP-SD和PLP-HFD小鼠在两个结构中总人αSyn蛋白水平无显著差异。随后，研究人员分析了αSyn病理的间接指标——丝氨酸129位点磷酸化的αSyns（pS129-αSyn）。研究发现PLP-HFD队列在黑质中pS129-αSyn含量显著更高，在纹状体中呈增加趋势。对黑质切片进行蛋白酶K（proteinase K, PK）处理可定量聚集态即病理性的pS129-αSyn（去除可溶性部分）。PLP-HFD小鼠在黑质中表现出比PLP-SD更高水平的PK抵抗性pS129-αSyn。
这些数据指向PLP-HFD小鼠中更高的病理性αSyn负荷。
**神经退行性变和精细运动障碍在PLP-HFD小鼠中加重**
研究人员进一步探究葡萄糖代谢紊乱是否可能导致MSA的第二大特征即黑质致密部（substantia nigra pars compacta, SNpc）多巴胺能神经元丢失。因此，研究人员对WT和PLP-SYN小鼠SD或HFD喂养4个月后的死后脑进行了黑质-纹状体多巴胺能通路组织化学分析。研究人员首先量化了SNpc中的酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase, TH）阳性神经元。PLP-HFD小鼠与PLP-SD小鼠相比，SNpc中多巴胺能神经元丢失呈强烈趋势。PLP-HFD小鼠还表现出SNpc中TH阳性染色显著减少。然而，PLP-HFD小鼠与任何其他实验组相比，纹状体中均无多巴胺能纤维丢失，这与需要大量TH阳性神经元丢失才能在纹状体中检测到相应TH纤维丢失的观点一致。
鉴于神经炎症在MSA相关神经退行性变中的关键作用，研究人员通过量化黑质和纹状体中离子化钙结合衔接分子1（ionized calcium-binding adapter molecule 1, Iba1）阳性小胶质细胞以及胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）阳性星形胶质细胞所占面积和分支状态（分形维数）来评估小胶质细胞和星形胶质细胞活化。未检测到WT与PLP-SYN小鼠之间或SD与HFD小鼠之间在微胶质细胞或星形胶质细胞含量方面的显著差异。这些发现提示PLP-HFD小鼠中观察到的神经退行性变加重独立于小胶质细胞或星形胶质细胞免疫反应性的改变。
最后，为评估精细运动技能，研究人员在T0+4个月时、动物处死前立即进行了平衡木行走测试。该行为测试用于测量训练有素小鼠的细微运动技能和平衡缺陷。如该月龄（6个月）的预期，PLP-SD小鼠未呈现显著的精细运动缺陷。相反，PLP-HFD小鼠在平衡木任务中错误次数显著高于WT-HFD小鼠，提示HFD加重并加速了PLP-SYN小鼠的运动障碍。
这些数据表明HFD加重了转基因PLP-SYN小鼠的多巴胺能神经元丢失并恶化了运动缺陷，且不影响小胶质细胞或星形胶质细胞免疫反应性。
**讨论部分总结**
本研究中，研究人员探究了饮食诱导的代谢改变与MSA样病理之间的潜在关联。初始探索性PCA纳入了27个与葡萄糖代谢、αSyn病理、神经炎症、神经退行性变和运动障碍相关的变量，鉴定出PLP-HFD小鼠独特的改变特征。这一独特特征主要由外周葡萄糖代谢异常和神经退行性变标志物驱动。
PLP-HFD小鼠表现出比WT-HFD对照更严重的外周葡萄糖稳态受损和更明显的胰岛素抵抗，表现为体重增加、高血糖、脂肪量增加以及葡萄糖和胰岛素挑战耐量降低。这些发现提示PLP-SYN小鼠中的少突胶质细胞α-突触核蛋白病直接或间接触加剧了HFD诱导的代谢紊乱，从而强化了MSA与代谢功能障碍之间可能的病理生理学联系。
除外周葡萄糖代谢紊乱和胰岛素抵抗外，以及旷场试验中脑胰岛素敏感性改变的部分证据外，研究人员在黑质中检测到IRS-1pSer307/总IRS-1水平——胰岛素抵抗的确定标志物——的显著差异，但未观察到PLP-WT和PLP-HFD小鼠之间的差异。这与研究人员此前的发现一致，即在PLP-SY小鼠纹状体中检测到IRS-1pS307水平升高。MSA中中枢胰岛素抵抗的问题仍然至关重要。除破坏下游胰岛素信号通路外，胰岛素敏感性受损可能损害神经元葡萄糖摄取，这对大脑异常高的能量需求尤为不利。这对代谢易损区域如黑质尤为相关，该结构在MSA中严重受累。需要进一步研究来确定HFD在多大程度上影响MSA背景下的中枢胰岛素抵抗。
神经病理学方面，PLP-HFD小鼠表现出更严重的改变，包括pS129-αSyn水平升高和多巴胺能神经元丢失增加，伴随精细运动损害的恶化。特别是，HFD不仅加重了神经病理学改变，还加速了临床表型，因为根据既往观察，6月龄时的运动缺陷并未被预期。这些发现与PD临床前模型的报告一致，其中HFD诱导的肥胖和胰岛素抵抗加重多巴胺能神经退行性变和运动功能障碍。多种机制被提出解释葡萄糖代谢紊乱和胰岛素抵抗如何可能增强多巴胺能神经元丢失，包括线粒体功能障碍、氧化应激增加、神经突起生长受损、突触缺陷和增强的促炎反应。尽管基于本研究评估的参数未检测到神经炎症反应性的证据，但细胞因子谱的评估对于更全面地描述炎症状态是必要的。此外，胰岛素抵抗已被证明通过增加背侧纹状体多巴胺 turnover（主要通过增强单胺氧化酶介导的降解）来破坏多巴胺能信号。另外，最近的在体证据表明HFD诱导的外周胰岛素抵抗可增加αSyn的S129磷酸化，与观察结果一致。这种pS129-αSyn负荷增加与polo样激酶2的表达升高相关，该激酶参与αSyn磷酸化。需要进一步的机制研究来确定受损的葡萄糖代谢如何导致MSA神经病理学加重。
作为局限性，研究人员承认对照饲料未与HFD进行成分匹配；因此，除脂肪含量差异外，维生素、矿物质和纤维的变化也可能对观察到的效应有贡献，在解释结果时应予考虑。此外，本研究仅纳入雄性小鼠；未来纳入雌性队列的研究将需要评估潜在的性别依赖性效应。
与PD患者中的观察类似，研究人员的发现支持临床转化，以确定在具有胰岛素抵抗或明显糖尿病的MSA患者中靶向葡萄糖代谢是否有助于减缓疾病进展。更广泛而言，研究结果支持探索降糖药物作为MSA潜在疾病修饰治疗的可能性。在此背景下，研究人员此前已证明艾塞那肽（一种获准用于糖尿病治疗的第一代GLP-1RA）在PLP-SYN小鼠模型中的治疗潜力。艾塞那肽可降低脑胰岛素抵抗标志物、保护多巴胺能神经元并减少纹状体单体αSyn水平。此外，一项2期、随机、单中心、开放标签临床试验评估了艾塞那肽在小型MSA患者队列中的安全性和有效性（25例接受每周艾塞那肽加标准治疗，25例仅接受标准治疗）。48周后，艾塞那肽组的统一MSA评分量表总分（主要终点）恶化6.1分，而标准治疗组恶化13.3分（P=0.0003）。尽管单中心、开放标签设计限制了确定性结论，这些鼓舞人心的发现值得在更大规模、多中心、随机、安慰剂对照试验中进一步探索。
**研究结论**
综上所述，本研究证明了MSA转基因小鼠模型中葡萄糖代谢受损与神经病理学改变之间的关联。研究结果进一步支持了靶向代谢功能障碍作为减缓MSA疾病进展策略的潜力，并为探索降糖药物是否能够提供治疗效益提供了额外的理论依据。
