综述：三种最常见突触后先天性肌无力综合征的表型差异及其分子致病机制调控

《Muscle & Nerve》：The Differing Phenotypes of the Three Most Common Postsynaptic Congenital Myasthenic Syndromes Governed by Their Underlying Molecular Pathogenic Mechanisms

　　

先天性肌无力综合征（CMS）是神经肌肉接头（NMJ）信号传递障碍的罕见疾病。尽管新一代测序技术（NGS）促进了肌无力相关基因变异的识别，但这些变异常为意义未明变异，临床诊断常被延迟。编码神经肌肉接头蛋白的AChR、RAPSN和DOK7基因突变是最常见的病因。识别由CHRNE突变导致的AChR缺乏、由RAPSN突变导致的AChR缺乏，以及由DOK7突变导致的"肢带型"肌无力综合征之间的关键表型特征，有助于实现早期诊断。虽然这三种疾病的严重程度均具有明显变异性且存在例外情况，但总体而言，CHRNE突变导致稳定的全身性易疲劳性无力伴明显眼外肌麻痹；RAPSN突变常导致新生儿或幼儿期呼吸危象，但随年龄增长倾向于缓解；DOK7突变则引起肢带型肌无力模式，可在出生时或行走运动里程碑达成后不久出现，呈缓慢进展但对治疗反应良好。这些表型差异及时间进程可由潜在的分子机制解释：对于CHRNE突变，患者至少部分依赖AChR的胎儿型发挥作用；对于RAPSN突变，突触后膜上AChR簇的稳定性被破坏；对于DOK7突变，终板结构的稳定性受到影响。这三种疾病均对可改变生命的治疗有反应，因此早期识别至关重要。

1 Introduction

先天性肌无力综合征（CMS)可根据缺陷性神经肌肉接头蛋白的位置进行广泛分类，因此常被分为突触前型、突触型和突触后型。诊断依赖于临床怀疑、电生理检查，以及日益重要的特异性基因变异识别及其功能效应分析。新一代测序技术（NGS）近来帮助识别了新的CMS致病基因，这些基因也可能在非肌肉组织中表达，甚至普遍表达，表明并非特异性局限于神经肌肉接头（NMJ）的蛋白缺陷也可导致肌无力。然而，由神经肌肉接头突触后蛋白突变导致的CMS最为常见，其中AChR ε亚基（CHRNE）、rapsyn（RAPSN）和downstream of kinase-7（DOK7）的变异占主导地位。影响肌肉AChR高效功能的分子机制有多种，如导致慢通道综合征、快通道综合征或传导降低的突变，但为便于与RAPSN和DOK7 CMS进行比较，本综述仅涵盖CHRNE中导致终板AChR缺乏的AChR突变。

2 The Developmental Profile of the Human AChR and Neuromuscular Synapse

肌肉AChR亚型的时序表达及神经肌肉接头的成熟过程对于确定不同形式CMS的表型至关重要。

肌肉AChR是典型的半胱氨酸环配体门控离子通道，为介导突触传递的糖基化跨膜离子通道。它们具有别构效应（存在多种不同构象），两个乙酰胆碱（ACh）分子与受体的结合有利于构象变化，导致通道短暂激活和阳离子内流。每个AChR由围绕中央离子孔的五聚体结构的五个亚基组成。哺乳动物肌肉中存在两种AChR类型：主要在胎儿肌肉中存在的由α₂βγδ组成的胎儿型，以及成人肌肉形式的α₂βδε型。各亚基为同源物，大小从437到495个氨基酸不等（信号肽序列切割后），由10至12个外显子的独立基因编码。在胚胎肌肉中，神经支配之前，胎儿型AChR沿肌纤维长度分布。神经支配过程中，AChR在突触后膜聚集并从突触外部位点消失。随着突触结构成熟，γ亚基（胎儿型）mRNA的转录被抑制，取而代之的是由突触下核转录的ε亚基（成人型）mRNA。在人类，ε亚基在妊娠晚期逐渐替代终板AChR中的γ亚基，但与小鼠中γ亚基表达在出生后3周完全关闭不同，人类γ亚基在成人肌肉中持续低水平表达。

从γ亚基到ε亚基表达的转变是神经肌肉突触成熟为复杂结构以促进高效信号传递的部分过程。

神经肌肉突触发育的经典观点来源于小鼠中神经肌肉接头组分被"敲除"的一系列实验。这些实验揭示了现称为AGRN-LRP4-MUSK-DOK7 AChR聚集通路的过程。简而言之，该通路为：运动神经末梢释放的agrin与突触后膜上的LRP4结合，后者与并激活受体酪氨酸激酶MuSK，MuSK进而激活下游通路，其中AChR β亚基被磷酸化，RAPSN则在突触后膜上聚集并稳定AChR。MuSK信号通过DOK7的胞内相互作用被刺激和放大。DOK7特异性结合MuSK，当在培养的C2C12细胞系肌管中表达时，即使在没有神经agrin的情况下也能诱导大量AChR簇形成。除刺激AChR簇形成外，这些蛋白质还参与终板突触结构的形成和稳定化。

如上所述，关于神经肌肉接头的大部分知识来源于小鼠研究，但值得注意的是，当将人类突变在小鼠相应位置重现时，CHRNE、RAPSN或DOK7突变导致了显著不同的表型。这可能反映了人类神经肌肉接头关键分子的表达谱改变和代偿性可塑性，这是小鼠所不具备的。结果是许多CMS患者能够存活且具有相对轻微的表型，而这种情况在小鼠同源模型中不会发生。这也表明，从小鼠临床前研究外推潜在新疗法对人类的功效（无论是正是负）时应谨慎。

3 AChR Deficiency due to Mutations in CHRNE

最常见的CMS为常染色体隐性遗传病，其中CHRNE（AChR ε亚基）突变导致终板AChR原发性缺乏。表型可从轻度到重度不等。无力通常在出生时或出生后第一年内显现，特征为喂养困难、上睑下垂、眼球运动障碍和运动里程碑延迟。眼球运动障碍并非总在新生儿早期显现，可能在第一年内发展。患者有时在青春期出现改善，总体而言疾病无进展。患者对抗胆碱酯酶药物或3,4-二氨基吡啶（3,4-DAP）有改善，临床病史中对上述治疗的改善可提示潜在的遗传病因。近来，β₂-肾上腺素受体激动剂的疗效也已被证实。3 Hz重复神经刺激通常显示复合肌肉动作电位（CMAP）递减，单纤维肌电图（SFEMG）显示抖动增加和阻滞。从活检肌肉的终板区域进行细胞内微电极记录显示， miniature end-plate potentials（MEPPs）和miniature end-plate currents（MEPCs）可能低于正常值。与MEPP和MEPC结果一致，¹²⁵I-α-银环蛇毒素或alexafluor偶联α-银环蛇毒素染色显示AChR数量减少，且常沿肌纤维异常分布。此外，电子显微镜显示突触后皱褶减少。

导致该CMS的突变位于ε亚基基因全长，可能引起移码和翻译提前终止，影响启动子或信号肽，或影响AChR五聚体的肽链折叠和组装。许多为无效突变。在这些情况下，以低水平整合入终板受体的γ或胎儿亚基残余表达能够介导突触传递，从而部分代偿成人AChR的丢失。支持该假说的证据包括：终板记录显示受体具有胎儿AChR的功能特性；AChR缺乏患者的运动终板存在γ亚基mRNA；以及成人AChR被胎儿AChR替代的动物模型模拟了人类疾病。通过残余γ亚基表达的部分代偿解释了为何大多数AChR突变位于CHRNE位点，因为人类终板可以适应ε亚基的丢失。

许多突变表现为"私有"突变，但欧洲人群中多个突变存在明显的奠基者效应。特别是突变ε1327delG，该突变倾向于表现为相对轻微的表型，在东南欧常见。轻度和重度AChR缺乏表型差异的潜在基础尚未确定，但可能的解释与γ亚基表达的水平和位置有关，或缺陷突变ε亚基对AChR五聚体组装的干扰有关。原位杂交显示AChR缺乏患者终板处突变ε亚基mRNA水平高。CHRNA1、CHRNB1和CHRND中的突变导致的AChR缺乏常引起严重表型，可能是因为它们无法被替代亚基的表达所代偿，但这些亚单位中每一亚基均有突变导致轻度表型CMS的例子。导致AChR缺乏的突变也可能改变AChR的动力学或功能特性。在这些情况下，原发性致病缺陷是终板AChR的丢失，改变的通道动力学具有继发效应。然而，如果终板AChR数量未严重减少，表型则由改变的离子通道动力学决定。

4 AChR Deficiency due to RAPSN Mutations

AChR聚集蛋白RAPSN的突变同样导致终板AChR缺乏。然而，这些患者的表型既不同于AChR缺乏综合征，也不同于AGRN-LRP4-MUSK-DOK7 AChR聚集通路突变导致的综合征，因此被归类为独立的CMS亚型。表现发作通常在出生时（早发型），尽管偶有早成年至中年发病的晚发型患者报道。早发型病例常伴有肌张力低下、明显的球部功能障碍（常需要鼻饲喂养）以及可能需要辅助通气。轻度面部畸形、高腭弓以及手和踝关节挛缩常见。虽然眼球运动通常正常，但斜视常见。儿童期病程与严重加重相关，常表现为危及生命的呼吸衰竭。患者随时间倾向于改善，6岁后严重呼吸暂停发作较少见，许多病例至成年期残疾轻微。晚发型患者可能被误诊为血清阴性免疫介导性重症肌无力。踝背屈无力在重症肌无力中不常见，可为RAPSN突变潜在病因提供线索。早发型和晚发型病例在慢速（3 Hz）重复神经刺激下均显示CMAP异常递减，SFEMG显示抖动，尽管并非总是易于检测。RAPSN突变患者对抗胆碱酯酶药物反应良好，加用3,4-DAP可能获得进一步改善。

在肌肉活检中，CHRNE突变导致的AChR缺乏与RAPSN突变导致的AChR缺乏的终板外观相似；然而，这两种疾病在临床上有明显区别。这些差异特征的潜在原因尚不清楚。但是，虽然ε亚基无效突变患者最可能通过维持低水平的胎儿（γ）亚基表达而存活，RAPSN突变患者则表达ε亚基。因此，成熟肌肉中RAPSN组与CHRNE组之间的一个明显差异是介导突触传递的终板AChR类型。

与许多CMS一样，RAPSN-CMS显示隐性遗传。RAPSN难以纯化和结晶，因此目前关于其结构的知识来源于需要验证的分子建模。突变见于蛋白质全长，但与其在RAPSN中的位置无明确表型关联。然而，大多数患者至少在一个等位基因上携带错义突变p.Asn88Lys（N88K），提示存在原始奠基者突变。RAPSN-N88K的频率表明其保留了至少部分功能，细胞培养实验支持这一点，其中RAPSN-N88K能够介导AGRN诱导的AChR簇，但这些簇比野生型rapsyn形成的簇稳定性差。许多其他变体被发现有大幅度抑制RAPSN功能和AChR/RAPSN相互作用，因此为无效突变。因此，N88K突变患者中AChR缺乏可能是由于终板RAPSN-N88K/AChR簇的不稳定性。RAPSN-CMS患者随时间改善且成年期常显示轻微无力的观察表明，神经肌肉接头一旦完全形成，其结构足以在没有RAPSN完全锚定的情况下将AChR维持在膜上。

大多数RAPSN突变导致的AChR缺乏患者至少在一个等位基因上携带N88K突变。在该疾病的首次描述中，所有四例报告病例均携带N88K；在39例的后续报告中，除启动子突变纯合子外，所有患者至少在一个等位基因上携带N88K。罕见患者为非N88K编码区突变的杂合或纯合子。已鉴定出一些RAPSN基因启动子区突变的患者。部分启动子突变严重降低rapsyn mRNA转录，但其他突变如?38A>G，对转录的影响不那么剧烈，该突变在常见面部畸形的伊朗犹太裔患者中被发现为纯合子。RAPSN突变患者观察到的面部畸形、高腭弓和关节挛缩均被认为源于胎儿运动减少，推测是由于胎儿发育关键阶段神经肌肉传递失败所致。因此，RAPSN突变必须影响成人型和胎儿型两种AChR亚型的聚集。

5 Congenital Myasthenic Syndromes due to Mutations in DOK7

AGRN-LRP4-MUSK-DOK7 AChR聚集通路的突变导致具有特征性"肢带型"肌无力模式的CMS。其中DOK7突变最为常见。疾病临床发作通常表现为初始达成行走里程碑后行走困难。患者偶有早期上睑下垂、肌张力低下、球部和呼吸问题的征象。行走和跑步障碍倾向于在儿童期恶化，伴上肢无力和部分患者丧失行走能力。摇摆和脊柱前凸步态常见，与近端下肢和躯干无力相关。上睑下垂常从早期存在，尽管在儿童期可能发展和进展。眼球运动通常正常，而面部、下颌和颈部无力常见，约50%成人患者观察到舌肌萎缩。症状在数周或数月内的波动常见。许多情况下，肌无力疾病的诊断可能延迟，肌营养不良和先天性肌病被建议。DOK7突变患者对β₂肾上腺素受体激动剂、麻黄碱和沙丁胺醇有显著改善。但与吡啶斯的明或3,4-DAP的典型肌无力反应通常在数小时内感受到不同，β₂肾上腺素受体激动剂的反应在数周至数月内逐渐发生，完全获益可能需要长达2年。RAPSN突变患者特征性的胎儿期关节畸形和踝背屈无力（与子宫内胎儿运动减少相关）在DOK7突变患者中未被观察到。

DOK7基因在小鼠中"敲除"时，神经肌肉接头未能形成，后代无法存活过出生。已在DOK7中鉴定出剪接位点、错义和移码突变，这些突变的隐性遗传导致上述特征性近端或"肢带型"无力的肌无力综合征。大多数突变位于基因的3′端大外显子，编码DOK7的C末端区域。1124_1127dupTGCC突变常见。DOK7被认为通过其磷酸酪氨酸结合结构域与MuSK的膜近端磷酸酪氨酸结合基序相互作用来激活MuSK，导致突触后膜中AGRN-LRP4-MUSK-DOK7复合物的二聚化和形成。即使C末端区域截短，这种结合仍可发生。来自DOK7突变患者运动终板的研究发现，神经肌肉接头成分以正常密度存在且功能正常，但突触前和突触后结构的大小远小于正常。在DOK7突变患者的初始研究中，所有（n=19）患者显示3 Hz刺激下CMAP递减和/或SFEMG上抖动和阻滞增加。此外，有证据表明突触结构发生退化和重建。这些观察结合突变DOK7对AChR聚集通路功能作用的研究，表明DOK7突变的主要效应在于神经肌肉接头结构的成熟和维持受损。

6 Summary

这三种CMS形式的关键临床特征已总结。对于CHRNE无效突变，一生中维持的低水平γ亚基表达使存活得以实现；在RAPSN-CMS中，AChR簇形成但不稳定；对于DOK7-CMS，神经肌肉突触的结构完整性维持受损。尽管所有病例中突触传递均受损，但这些不同的潜在致病机制导致了不同的表型特征。人类疾病相对于小鼠模型的对比性较轻严重程度，提示人类神经肌肉接头 multiple尚有未理解的方面，但该突触即使晚期仍能对治疗产生反应的可塑性，为正在开发的新疗法的功效带来了良好前景。