《Neuropathology and Applied Neurobiology》：Unravelling the Significance of Cystatin C and Bunina Bodies in Amyotrophic Lateral Sclerosis Pathogenesis
肌萎缩侧索硬化（Amyotrophic lateral sclerosis, ALS），又称运动神经元病（Motor neuron disease, MND），是一种主要累及运动神经元的致命性神经退行性疾病。人类组织病理中下运动神经元内存在的两种关键蛋白包涵体是该病的神经病理学特征：TDP-43阳性包涵体与胱抑素C（Cystatin C）阳性的Bunina小体。尽管Bunina小体具有诊断特异性，且存在于大多数散发性与家族性ALS病例中，但其研究仍十分有限，其真实患病率很可能被低估。Bunina小体与TDP-43包涵体的共存可能为揭示ALS中TDP-43病变的发生机制提供重要线索，因此需要对Bunina小体进行全面表征，以理解这种相互作用及更广泛的疾病发病机制。本综述梳理了当前关于Bunina小体的认知，以及可能促进胱抑素C聚集的生化特性。胱抑素C被隔离并聚集为Bunina小体的过程可能削弱其神经保护功能，包括半胱氨酸蛋白酶抑制、自噬诱导及抗淀粉样生成活性，从而参与ALS的发病过程。本综述同时评估了来自人类尸检组织与ALS疾病模型的研究结果，讨论了这些模型在Bunina小体与TDP-43病变研究中的价值与局限性。最后，研究人员探讨了胱抑素C作为生物标志物的应用潜力及治疗前景。深入理解胱抑素C生物学特性、其与TDP-43病变的关系，以及优化ALS疾病模型，对于确定靶向胱抑素C是否可为未来ALS治疗提供可行路径至关重要。
1 引言
肌萎缩侧索硬化（ALS）是运动神经元病最常见的临床类型，属于一类累及运动神经元的神经退行性疾病。欧洲地区ALS发病率为每10万人年1.11至5.55例，患病率为每10万人群3.44至10.80例，不同地区发病率与患病率存在显著差异，这与各地区遗传背景不同于欧洲人群有关。由于疾病进展迅速且无有效治愈手段，该病呈现低患病率但相对高风险的特征。上、下运动神经元变性导致肌无力与痉挛，通常在确诊后3至5年进展为呼吸衰竭并死亡。在英国，“运动神经元病”与“ALS”常作为同义词使用，因为ALS是运动神经元病最常见的临床表现，因此本综述统一使用“ALS”指代该病。
与其他神经退行性疾病类似，ALS兼具遗传与散发起源。约10%的ALS病例为家族性（fALS），目前已发现50余个基因突变与该类型相关，多数遵循常染色体显性遗传模式。然而大量临床与人群队列数据显示，相当一部分看似“散发性”的ALS患者实际携带致病突变，提示外显率降低是ALS相关基因的普遍特征。最常见的突变位于染色体9开放阅读框72（C9orf72）、超氧化物歧化酶1（SOD1）、TAR DNA结合蛋白（TARDBP）及肉瘤融合蛋白（FUS）基因。其余90%至95%的患者为散发性ALS（sALS），与fALS存在显著的临床与病理重叠。目前ALS尚无治愈方法，疾病修饰治疗手段十分有限，美国食品药品监督管理局仅批准了三种药物：利鲁唑与依达拉奉仅能轻微延长生存期，其中仅利鲁唑在欧洲获批；第三种托夫生是针对SOD1基因的反义寡核苷酸药物，可减少毒性蛋白产生，近期在美国与欧洲获批，但仅适用于携带SOD1突变的少数患者。
ALS的临床诊断要求同时存在上、下运动神经元受累体征，其命名分别对应两个关键病理改变：肌萎缩（肌肉萎缩）与侧索硬化（皮质脊髓束——上运动神经元轴突变性）。除上述改变外，还存在多种其他神经病理变化：大脑中运动皮质的上运动神经元及中间神经毡发生变性，导致中央前回萎缩；特定脑干运动核团（尤其是面神经核与舌下神经核）发生变性，延髓锥体可出现退行性改变；合并痴呆的患者可见额颞叶皮质萎缩，该表现在接受额颞叶痴呆（FTD，对应病理诊断为额颞叶变性）临床诊断的个体中最为显著。由于部分FTD亚型与ALS存在遗传及病理重叠，二者被认为处于同一疾病谱系。脊髓层面，前角下运动神经元变性，前根丝变薄，白质尤其是皮质脊髓束发生退行性改变。运动神经元变性并非ALS的唯一细胞特征，尸检组织可见显著的小胶质细胞活化反应，与健康对照相比，反应性星形胶质细胞（GFAP阳性）表型增多，少突胶质细胞中存在蛋白聚集体，髓鞘碱性蛋白减少与脱髓鞘也是ALS的典型特征。
尸检剩余运动神经元与少突胶质细胞内的蛋白聚集体是疾病的病理标志：约97%的ALS病例可观察到含有43 kDa反式激活应答DNA结合蛋白（TDP-43）的泛素化胞质包涵体。生理状态下，约90%的TDP-43位于细胞核内；而在ALS中，TDP-43从核内转移至胞质并形成聚集体，常被截短为羧基末端片段，可发生过度磷酸化与泛素化。目前已鉴定出50余个编码TDP-43的TARDBP基因致病突变，但这些突变仅占fALS病例的约4%，而TDP-43包涵体见于97%的所有ALS病例（包括散发型与其他遗传型），因此TDP-43聚集是ALS的核心病理标志。尽管TDP-43聚集是大多数ALS类型的核心特征，但它也可见于其他被统称为TDP-43蛋白病的疾病中，这引发了关于是什么区分ALS与其他TDP-43蛋白病，以及是什么导致无TARDBP突变的大多数ALS病例发生TDP-43蛋白病的疑问。此外，在一些其他神经退行性疾病（如阿尔茨海默病与帕金森病）中也可观察到继发性TDP-43聚集体与其他蛋白聚集体并存。TDP-43病变在这些疾病中的确切作用尚存争议，因此如果TDP-43病变可能是其他病理过程的效应而非原因，那么在没有TARDBP突变的病例中，TDP-43病变也可能是继发性病变。一种可能的解释与ALS的第二大病理标志——Bunina小体相关。
本综述将聚焦于Bunina小体及其核心组成蛋白胱抑素C。尽管Bunina小体与ALS普遍存在且特异性相关，但其研究仍远不及泛素化TDP-43阳性包涵体充分。本综述总结了表征Bunina小体的相关研究、胱抑素C聚集的可能机制、胱抑素C的神经保护与毒性作用，以及TDP-43与胱抑素C之间的相互作用。研究人员认为Bunina小体的形成可能是驱动ALS发病机制的因素之一，调控胱抑素C有望成为未来潜在的治疗干预方向。
2 The Bunina Body
Bunina小体是ALS特异性的病理包涵体，截至目前尚未在其他疾病中被发现。该包涵体位于下运动神经元内，于1962年由苏联神经病理学家Tat'yana Bunina在2例fALS病例中首次描述，最初被认为是可能的嗜神经病毒，但后续研究未证实其可传播性或病毒起源，其具体来源至今仍未明确。
这类胞质内包涵体体积较小（1至5 μm），呈圆形或椭圆形，具有强嗜酸性。电镜显示Bunina小体包含无定形电子致密物质，无外包膜，但周围环绕囊泡状或管状结构。其形态具有多样性：可表现为单个圆形包涵体，中心区域偶有弱免疫反应性，也可呈链状或簇状分布于胞质或神经元突起内。重要的是，Bunina小体免疫染色阳性针对胱抑素C，且最常见于胱抑素C免疫反应性降低的神经元中，极少数情况下可在胱抑素C高表达的神经元或染色质溶解的神经元中观察到。
Bunina小体最常出现在ALS的下运动神经元中，也有少量报道见于Betz细胞、蓝斑、延髓网状结构及其他脑区，非运动区或运动外区域的Bunina小体较为罕见，但可能提示在病程较长或侵袭性较强的病例中病变发生了播散，这也可能是ALS人群异质性的来源之一。
Bunina小体可见于sALS、C9orf72相关fALS，以及通常伴随TDP-43病变的罕见基因突变病例（如血管生成素ANG、膜联蛋白A11 ANXA11、共济失调蛋白2 ATXN2、DNAJC7）。与之相反，SOD1相关fALS（无TDP-43病变）中不存在Bunina小体；FUS相关fALS同样缺乏TDP-43蛋白病，部分研究通过苏木精-伊红（H&E）染色报道存在Bunina小体，但并非所有研究均观察到该现象。目前关于Bunina小体患病率的报道差异较大，最大规模的sALS尸检研究估计86%的病例存在该病变，该研究仅使用H&E染色且每例切片数量未明确；其他研究采用每例3张切片的胱抑素C免疫组化检测，仅23%的sALS病例观察到Bunina小体。这种患病率差异很可能来源于检测方法选择、病例数或分析切片数量的差异。
尸检报告显示Bunina小体病变在ALS中广泛且早期受累：一名确诊仅5个月便自杀的ALS患者，其下运动神经元已存在Bunina小体；一例额叶痴呆病例仅在尸检时通过舌肌神经源性萎缩提示可能存在运动受累，其舌下神经核已可观察到Bunina小体，证明其在运动症状出现前即可存在。反之，一名依赖人工通气支持生存至终末期的患者，其动眼神经核与延髓网状结构等罕见受累部位也观察到了Bunina小体病变，提示在长期患病过程中，该病变可广泛累及罕见受累的运动核团及非运动区域。
多种与神经退行性疾病相关的蛋白（如p62、β-淀粉样前体蛋白、α-突触核蛋白与tau）均不与Bunina小体共定位或关联。与大多数其他病理包涵体不同，Bunina小体基本不表达泛素免疫反应性，尽管部分研究结果不一致，偶尔报道少数Bunina小体存在泛素化，但目前尚不清楚这是胱抑素C本身的泛素化还是Bunina小体与泛素化包涵体共定位所致。已有研究报道TDP-43偶尔与Bunina小体共定位，且存在Bunina小体的神经元中TDP-43包涵体的发生率显著高于无Bunina小体的神经元。多项来自不同实验室的研究（采用免疫荧光双标、连续H&E染色与抗TDP-43免疫组化等不同技术）均证实了这种病理关联：最早的研究显示含TDP-43包涵体的神经元均存在Bunina小体，而Bunina小体也可出现在无TDP-43包涵体的神经元中；后续更大样本量的研究显示，33.9%的含TDP-43包涵体神经元同时存在Bunina小体，81.8%的含Bunina小体神经元同时存在TDP-43包涵体，且含Bunina小体神经元中TDP-43包涵体的发生率显著更高。这种共定位与毗邻关系的意义尚不明确，但提示两种包涵体及其形成过程之间存在关联。目前Bunina小体病理的低估限制了此类研究的深入：神经元游离胞质胱抑素C耗竭的表现更为明显，因此以胞质胱抑素C耗竭作为Bunina小体的替代指标或可规避这一问题——98.9%的含TDP-43包涵体神经元存在胞质胱抑素C弱表达或无免疫反应性。
1993年Okamoto等人首次报道Bunina小体免疫阳性针对胱抑素C，其为主要的聚集成分。后续研究还发现转铁蛋白、外周蛋白、脑表达sortilin相关受体2与前鞘糖脂激活蛋白也可部分定位于Bunina小体，但胱抑素C免疫组化仍是观察该结构的最佳方式。尽管H&E染色也可观察到Bunina小体，但边界不清易漏诊，且免疫组化可同时捕捉到Bunina小体形成伴随的游离胞质胱抑素C丢失，因此是更适宜的检测方法。此外，Bunina小体体积仅1至5 μm，而运动神经元胞体直径可达50至100 μm，除非对整条运动神经元进行检查，否则无法明确神经元内是否存在病变，这也是现有数据不完整的重要原因——即使病变存在也可能难以检测到。多位研究者指出，初始未发现Bunina小体的病例，在检查更多切片后可观察到该病变，这是ALS病理组织学分析的显著局限。此外，曾有1次报道在神经元树突中发现Bunina小体，若该表型普遍存在，则病变分布可能更广泛。受限于采样差异与研究不足，Bunina小体在神经元胞体、突起、中枢神经系统及患者群体中的真实患病率仍不明确，目前唯一明确的方法是采用抗胱抑素C免疫组化对尸检组织进行大规模神经病理学评估，但组织可获得性是主要限制因素。
3 Cystatin C
3.1 结构与功能
胱抑素C由CST3基因编码，属于2型胱抑素超家族，分子量为13.3 kDa。与其他2型胱抑素类似，胱抑素C由围绕单条α螺旋的反平行β折叠构成。其羧基末端存在两个二硫键，对蛋白稳定性至关重要。
作为典型的分泌蛋白，胱抑素C合成时为前体蛋白，N端带有26个氨基酸的信号肽，介导蛋白通过分泌途径转运，信号肽被切除后形成成熟的120氨基酸蛋白。活性单体胱抑素C主要通过与靶标形成可逆的高亲和力结合，发挥半胱氨酸蛋白酶（如组织蛋白酶B与S）抑制剂的作用。在细胞外空间，胱抑素C在调节组织重塑中发挥关键作用，可防止过度的细胞外基质重构。其他细胞外功能包括免疫调节与抗微生物活性、抑制淀粉样蛋白形成、维持血脑屏障完整性。胱抑素C也可从细胞外环境被细胞摄取，靶向溶酶体发挥蛋白酶抑制作用。尽管胱抑素C由所有有核细胞表达并存在于所有体液中，但在下运动神经元胞质内浓度尤其高，提示其在该类细胞中具有特定功能。
3.2 聚集形成
生理状态下，胱抑素C在体内外均以单体形式存在。但其分子结构、氨基酸序列及可能的翻译后修饰的多个特性使其更易在细胞内空间发生聚集。
首先，胱抑素C可发生三维结构域交换，即单体交换相同的结构亚结构域形成二聚体或更高阶寡聚体，这一过程是胱抑素C二聚化的基础，其聚集很可能通过级联结构域交换实现，即长链的单体关联形成，而非结构域交换的胱抑素C二聚体组装。胱抑素C的结构域交换与纤维形成高度依赖于局部化学环境，pH、温度与蛋白浓度均会影响其聚集倾向。
其次，突变与蛋白修饰会增加其淀粉样生成倾向。冰岛遗传性胱抑素C淀粉样血管病（HCCAA-I）是脑淀粉样血管病最严重的类型，患者发病年龄早，平均死亡年龄约30岁，由CST3基因L68Q显性突变导致，该突变增加了稳定态胞外蛋白的结构域交换速率，极易形成聚集体，进而导致淀粉样变与脑出血。对该突变的研究鉴定出胱抑素C内部被称为“聚集倾向核心”的短肽序列，可进一步指导纤维形成。在HCCAA-I患者的胞外淀粉样聚集体中，N端截短的胱抑素C（经弹性蛋白酶切割，缺失前10个氨基酸）是L68Q突变胱抑素C的主要存在形式，该截短形式可通过与全长胱抑素C相同的结构域交换方式形成二聚体，但聚集倾向更高。
第三，胱抑素C的蛋白稳定性依赖于两个交联三维结构的二硫键，该键通过两个半胱氨酸残基的氧化反应形成，是分泌蛋白的常见特征，在氧化的细胞外环境中易于形成以稳定三级结构。相反，细胞胞质的还原环境会破坏这些二硫键的稳定性，因此即使在相对较低的胞内浓度下，蛋白也更易发生聚集。研究显示，破坏鸡卵清胱抑素（与人类胱抑素C结构和功能高度相似）的二硫键会加速其二聚化；反之，胱抑素C二硫桥的不稳定会促进结构域交换，而增加二硫键可提供额外稳定性，抑制二聚化并减少向淀粉样纤维的转变。
最后，相分离是指均匀混合物自发分裂为两个或多个组分浓度不同的液相的现象，可形成无膜细胞区室，进而允许复杂的生化反应发生。近年相分离被认为是神经退行性疾病中异常蛋白聚集的潜在机制，TDP-43等关键蛋白已被证实可发生相分离。此外，带正电的分子在胞质中易与其他带负电的大分子发生分子簇集，从而促进液-液相分离。胱抑素C带较高的正电荷（等电点pI=9.2），这可能增加其在胞质中发生相分离的倾向，进而促进胞内不溶性聚集。
显然，促进胱抑素C聚集的特性可能在ALS中具有重要作用，胱抑素C形成高分子量纤维的能力可能是Bunina小体形成的基础。目前仍有诸多问题有待解答：Bunina小体中是否存在结构域交换寡聚体或N端截短形式的胱抑素C？胱抑素C是否发生液-液相分离？稳定蛋白单体结构（如在转甲状腺素蛋白淀粉样变治疗中已获成功）是否可以阻止Bunina小体形成？
4 神经系统疾病中的胱抑素C
胱抑素C在中枢神经系统中高表达，脑脊液浓度是血浆的4倍，因此与多种中枢神经系统疾病相关。如前所述，CST3基因L68Q常染色体显性突变导致胱抑素C淀粉样变，引发HCCAA-I患者脑出血、卒中与早发死亡；CST3基因的杂合截短变异与8个家系报道的常染色体显性成人起白细胞营养不良相关；CST3基因多态性与脑白质病变及皮质白质改变导致的认知下降相关。A25T氨基酸改变（称为胱抑素C变异体B）改变了前体胱抑素C的分泌靶向序列，与年龄相关性黄斑变性及阿尔茨海默病的易感性相关。阿尔茨海默病患者尸检脑组织中，胱抑素C与β-淀粉样蛋白纤维共定位，且颞叶神经元胱抑素C升高，尤其在易受损的皮质Ⅲ、Ⅴ层锥体神经元中最为显著。帕金森病中，血清胱抑素C水平升高与认知下降及疾病严重程度相关，更高的血清胱抑素C水平也与缺血性卒中风险增加相关。
5 人类ALS中的胱抑素C
5.1 胱抑素C作为ALS生物标志物
除在下运动神经元中聚集为Bunina小体外，ALS患者脑脊液胱抑素C水平降低，因此其作为生物标志物的价值一直存在争议。与健康对照或其他神经系统疾病对照相比，ALS患者脑脊液胱抑素C水平大多显著降低，血液样本水平升高。但结果存在异质性，可能与检测方法不同及样本量较小有关。目前尚不确定细胞外胱抑素C是否与疾病进展、ALS功能评分量表修订版（ALSFRS-R）评分或生存时间等重要疾病参数相关，这些细胞外检测指标可能无法准确反映细胞内病理改变，因为表达水平、溶解度与排泄等多种参数均会影响细胞外蛋白水平。现阶段，脑脊液或血液胱抑素C与ALS诊断之间似乎无可靠关联，但有研究显示较高的脑脊液胱抑素C可能预测更长的生存期。
5.2 在ALS中研究CST3
对57例sALS与12例非SOD1 fALS的PCR筛查未发现ALS致病性CST3基因突变。但全基因组关联研究提供了更全面的CST3与ALS关联证据：利用基因型-组织表达数据库（GTEx）鉴定与中枢神经组织CST3表达相关的表达数量性状位点（eQTL），发现一个单核苷酸多态性与CST3表达升高相关，其效应等位基因“T”与ALS风险增加相关，这与“中枢神经系统中CST3表达升高导致ALS风险增加”的模型一致。此外，如前所述，CST3突变分别导致HCCAA-I或白细胞营养不良，目前尚未见此类病例开展ALS相关病理评估的报道。
5.3 ALS尸检组织中的胱抑素C
神经健康对照的下运动神经元中，胱抑素C呈高胞质浓度表达；相比之下，大多数sALS下运动神经元中胱抑素C免疫反应性降低：81.1%的下运动神经元胱抑素C免疫染色弱或无染色，而神经健康对照仅为10.1%，其他神经系统疾病对照仅为5.0%，体现了疾病特异性。
Mori等人的研究显示，所有可观察到胱抑素C阳性Bunina小体的sALS神经元均存在游离胞质胱抑素C免疫反应性降低，提示Bunina小体隔离了游离蛋白。但75.1%的胞体无可观察Bunina小体的下运动神经元也存在胱抑素C免疫反应性降低，这可能与Bunina小体存在于神经突起中有关——若突起无法在组织切片中追溯到所属神经元胞体，则无法评估胞质胱抑素C状态。目前仅有一篇报道记录树突Bunina小体，但可能更为普遍。
关于ALS中胱抑素C病变下游效应的改变存在不同报道。早期免疫组化研究显示，含Bunina小体的神经元中组织蛋白酶B特异性降低，但未被后续研究复现。sALS脊髓组织的cDNA微阵列数据显示，与健康对照相比，组织蛋白酶B mRNA上调，但该降低在激光捕获运动神经元的mRNA中并不明显。RNA水平可能与蛋白水平不直接相关，胱抑素C对蛋白酶的调控可能发生在蛋白水平而非mRNA水平。明确ALS中胱抑素C下游靶点（如组织蛋白酶）的作用，将有助于理解可溶性胱抑素C减少与Bunina小体形成的潜在病理效应。
胱抑素C的改变也见于非神经组织：ALS患者皮肤活检显示表皮胱抑素C显著升高，提示胱抑素C存在广泛的系统性改变。
尽管这些报道可为病变患病率提供重要参考，但尸检组织研究局限于终末期疾病，仍需ALS模型进一步阐明其中的神经退变机制。
6 ALS疾病模型中的胱抑素C
尽管人类病理研究明确了Bunina小体与疾病的明确相关性，但该类方法无法确立因果关系，因此体外与体内模型可辅助理解胱抑素C在ALS中的作用。遗憾的是，目前相关数据极少且与人类疾病相关性有限。首先，胱抑素C病变仅见于伴TDP-43病变的病例，而良好的TDP-43蛋白病动物模型十分稀缺。SOD1模型应用广泛，但由于人类SOD1-fALS不存在Bunina小体与TDP-43病变，其对胱抑素C与Bunina小体病理的研究价值十分有限，SOD1模型的数据仅能提供神经营养或毒性的通用见解，无法为伴TDP-43病变的MND/ALS研究提供有效信息。研究显示，在SOD1-G85R N2a模型中，胱抑素C通过抑制组织蛋白酶B与mTOR介导的自噬发挥保护作用；在SOD1-G93A小鼠疾病早期脑室内注射胱抑素C可延长生存期。但SOD1-G93A小鼠腹角运动神经元中观察到的胱抑素C聚集体难以解释，部分聚集体形态与人类Bunina小体存在差异，且不伴随游离胞质胱抑素C丢失；胱抑素C灌注小鼠中单体可溶性胱抑素C显著降低，而Triton X-100不溶性胱抑素C寡聚体（分子量约50 kDa）显著升高，由于这些小鼠生存期延长，提示Bunina小体可能具有神经保护作用。
在基于TDP-43的ALS模型中，胱抑素C相关研究仍然有限。C9orf72多聚PR非人灵长类ALS模型显示，脑脊液中胱抑素C水平与疾病进展正相关，与人类疾病表现一致，但研究者未评估剩余运动神经元中胱抑素C聚集体的存在，且脑组织未见TDP-43或磷酸化TDP-43聚集体积累。直接证据来自过表达野生型TDP-43的非人灵长类模型：通过腺相关病毒载体将TDP-43递送至颈髓，在部分剩余下运动神经元中观察到小的胱抑素C阳性颗粒，仅见于外源性表达核TDP-43的神经元中，虽与人类Bunina小体有一定相似性，但未展示与未受累神经元的比较，限制了结果解读，且这些颗粒不与胞质TDP-43共定位。据研究人员所知，这是目前唯一同时报道胱抑素C与TDP-43病变的模型，目前尚无Bunina小体病理的专用模型。
目前探索TDP-43与胱抑素C关系的模型数据匮乏是需要解决的关键问题，ALS细胞模型中胱抑素C扰动的研究尚未开展，sALS来源的诱导多能干细胞及分化得到的运动神经元是合理且相关的研究起点。
7 胱抑素C具有神经保护作用——其功能丧失是否参与ALS发病机制？
研究显示16.9%的下运动神经元中存在Bunina小体，但伴随该包涵体的胞质胱抑素C耗竭见于81%的下运动神经元。鉴于Bunina小体在ALS中的重要性，游离可溶性胱抑素C的作用是需要深入探索的重要方向。ALS运动神经元内游离胞质胱抑素C减少很可能导致其功能丧失，而这些功能具有神经保护性，在疾病中可能减弱，从而成为驱动发病机制的因素之一。体外与体内证据显示，胱抑素C通过多种机制发挥神经保护作用：
首先，胱抑素C是抗淀粉样生成蛋白：非聚集状态下，其可减少体外与体内β-淀粉样蛋白纤维的形成，并促进脑内皮细胞中淀粉样前体蛋白（APP）的非淀粉样加工。在APP转基因阿尔茨海默病小鼠模型中，过表达可溶性胱抑素C可显著减少新皮质β-淀粉样纤维积累，该淀粉样清除机制通过激活小胶质细胞髓系细胞触发受体2（TREM2）实现，从而促进斑块降解。体外实验也证实，当Aβ1-40与单体胱抑素C共孵育时可见上述效应；而与聚集态胱抑素C共孵育则结果相反，总β-淀粉样纤维水平显著升高。
其次，胱抑素C是促进自噬的蛋白。自噬是清除错误折叠蛋白与受损细胞器的细胞过程，对稳态维持与神经元健康至关重要，该过程在大型终末分化运动神经元中尤为重要，自噬健康与包括ALS在内的多种神经退行性疾病的神经变性明确相关。研究显示胱抑素C通过抑制mTOR诱导自噬：向N2a细胞添加细胞外胱抑素C可增加LC3-I向LC3-II的转化，提示自噬体形成；若使用3-甲基腺嘌呤或beclin 1 siRNA抑制自噬，胱抑素C的这些神经保护作用会被阻断。在帕金森病体内模型中，向黑质施加胱抑素C可增强神经元自噬，并显著降低磷酸化α-突触核蛋白水平。维持适当的自噬水平对神经元健康至关重要，运动神经元中活性单体胱抑素C减少很可能具有有害影响。
第三，胱抑素C作为半胱氨酸蛋白酶抑制剂可促进神经元存活。小鼠敲低其主要靶标组织蛋白酶B可减缓神经损伤后的运动神经元死亡，提示胱抑素C介导的组织蛋白酶B抑制可减少神经毒性。大鼠脑出血模型显示组织蛋白酶B表达升高，胱抑素C可降低该表达，同时减轻严重脑水肿与神经功能缺损评分，再次证明胱抑素C的神经保护功能。
此外，除上述胞内机制外，越来越多的证据表明胱抑素C可通过分泌发挥神经保护作用。装载胱抑素C的细胞外囊泡在体外对原代神经元具有抗细胞死亡的保护作用；在卒中小鼠模型中，脑室内注射细胞外囊泡可显著增加突触标记物，提示神经保护与突触保留作用。携带阿尔茨海默病相关早老素2突变的小鼠原代皮质神经元，其分泌的外泌体中胱抑素C减少，提示该减少可能是疾病的促成因素。这些结果共同证明胱抑素C负载的细胞外囊泡具有神经保护作用，提示通过调控胱抑素C提升可溶性活性蛋白水平可能是未来干预的有前景的方向。
最后，胱抑素C在氧化应激反应中表达上调。高氧条件可导致培养神经元发生氧化应激诱导的细胞死亡，此类神经元中胱抑素C mRNA与蛋白水平显著上调；PC12神经元中胱抑素C表达可显著提高对氧化应激诱导细胞死亡的抵抗力；过氧化氢处理的大鼠原代皮质神经元中，向培养基添加胱抑素C可促进细胞存活。这些数据提示胱抑素C升高可能具有保护作用。
综上，胱抑素C通过抑制淀粉样蛋白形成、促进自噬、抑制半胱氨酸蛋白酶及分泌作用发挥神经保护效应，且在氧化应激等ALS发病机制相关的细胞事件中被上调。胱抑素C水平可能受到严格调控，病理细胞事件导致的胱抑素C mRNA与蛋白水平升高可能破坏其精细平衡，使聚集更易发生。中度升高可溶性胱抑素C水平可能具有神经保护作用，但在胞内还原环境叠加其他疾病相关事件的情况下，蛋白溶解度阈值降低，其聚集为Bunina小体并伴随后续功能丧失，很可能造成神经保护缺失。这些聚集态物种充其量无活性，最坏情况下具有致病性，可能参与疾病发病机制。
8 胱抑素C是否会加重神经毒性？
多种神经退行性疾病中均报道胱抑素C升高，但其是病因还是疾病结果尚不明确。尽管胱抑素C具有神经营养效应，但在部分情境下也被证实具有神经毒性：
大鼠海马内注射胱抑素C可导致显著神经元丢失，该效应可被共注射组织蛋白酶B抵消；胱抑素C处理的培养人神经元中也观察到相同现象，伴随DNA片段化增加与凋亡通路关键蛋白caspase-3上调。体外研究显示，毒素诱导损伤后多巴胺能神经元分泌胱抑素C，导致小胶质细胞活化并加剧神经元损伤，这一效应在帕金森病模型中得到验证。更多体外证据来自PC12细胞分化的神经元过表达胱抑素C，可促进tau磷酸化与微管不稳定，该机制可能通过未折叠蛋白反应（UPR）实现，该信号通路在未折叠蛋白过载时被激活，并在细胞应激期间与tau磷酸化相关，提示胱抑素C参与阿尔茨海默病发病机制与神经变性。
为何部分研究报道神经保护作用，而其他研究操作胱抑素C水平时发现毒性，目前原因仍不清楚。显然该操作会影响蛋白水解过程，这是一个调控极为严格且敏感的细胞过程，在ALS中已发生异常。可溶性胱抑素C的正确比例对其蛋白酶靶标至关重要，可能对神经元健康具有决定性意义。可能存在极窄的可溶性胱抑素C浓度窗口具有获益，超出该范围则会促进胱抑素C聚集与蛋白水解失调。未来若要利用这些获益效应，需要精准界定该窗口。最后，目前大多数研究关注可溶性胱抑素C的应用，针对ALS的一个有趣研究方向是探索Bunina小体形成的潜在毒性增益效应及如何减轻该效应。
9 干预策略
目前迫切需要能够延缓或阻止ALS运动神经元变性的疗法。靶向胱抑素C以恢复其神经保护功能或阻止其聚集为Bunina小体，可为未来干预提供方向。天然还原剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）已被证实在体外可阻止胱抑素C淀粉样纤维形成，并在体内调节HCCAA-I的疾病相关病理。NAC还可抑制氧化应激条件下胱抑素C从溶酶体泄漏，并在表达突变SOD1的N2a细胞中减少其聚集。值得注意的是，HCCAA-I患者服用NAC补充剂后，皮肤活检与血浆中L68Q型胱抑素C的聚集显著低于疾病对照。NAC作为抗氧化剂可增加谷胱甘肽水平，而谷胱甘肽在ALS中耗竭。NAC已在ALS中开展临床试验，未显示生存改善的统计学显著性，但有观点认为该初始试验统计效力不足，且对不同疾病亚型似乎存在相反效应，提示需要进一步扩大样本量的试验全面评估该药物。目前尚不清楚胱抑素C是否在Bunina小体内发生纤维形成。谷胱甘肽（另一种还原剂）已在临床试验中测试，未显著改善结局，原因是谷胱甘肽难以透过血脑屏障且在血液中代谢迅速。其他口服谷胱甘肽替代给药方式在其他神经退行性疾病中显示出前景。NAC酰胺或NAC乙酯因更优的药代动力学特性，可在ALS中开展试验，靶向减少胱抑素C聚集，期望其作用机制与HCCAA-I中类似，即减少胱抑素C聚集。值得注意的是，一项NAC酰胺治疗HCCAA-I患者的临床试验正在进行中。其他靶向胱抑素C的路径，如药物筛选库与单克隆抗体，已显示出抑制胱抑素C二聚化的能力，可作为HCCAA-I的治疗方向，但该类方法用于ALS下运动神经元减少胱抑素C二聚化时，还需解决分子穿透血脑屏障并进入下运动神经元的问题。NAC酰胺与NAC乙酯的药代动力学特性使其有可能实现这一目标。
10 结论与未来方向
综上，与阿尔茨海默病等其他神经退行性疾病类似，ALS至少与两种 distinct 蛋白病相关——胱抑素C与TDP-43相关病变。尽管TDP-43相关研究已十分广泛，但胱抑素C与Bunina小体在ALS中的作用仍知之甚少。必须明确胱抑素C耗竭与Bunina小体在神经元内、神经突起内及患者群体中的真实患病率，以理解该病变的范围。为推进对ALS中胱抑素C的理解，必须使用更能模拟伴TDP-43病变ALS的体内模型，因为人类SOD1-fALS及相应的SOD1模型均缺乏TDP-43包涵体与Bunina小体。此外，这两种ALS病理特征之间的关系值得深入研究，理解其相互作用可提供更整体的发病机制认知。重要的是，探索胱抑素C的神经营养特性及如何保留这些特性，有望提供潜在的治疗策略。
