响应杨树低温胁迫的关键调控基因的鉴定及功能特征

《Plant Physiology and Biochemistry》：Identification and functional characteristics of key regulatory genes in Populus alba in response to cold stress

　　

森林作物在休眠解除后特别容易受到低温胁迫的影响。新萌发的嫩枝尤为脆弱，枝条的死亡会导致生物量产量的严重损失。因此，揭示森林树木低温胁迫响应的分子机制至关重要。银白杨（Populus alba）是一种分布于全球、具有抗寒性的树种。在该研究中，研究人员对银白杨响应低温胁迫的转录组进行了分析，发现大量基因在根和叶组织中均上调表达。通过Mfuzz聚类分析和系统发育分析，四个乙烯响应因子（ethylene-responsive factor，ERF）基因（PoalbERF73/80/86/124）被鉴定为低温响应基因。这四个基因属于ERF家族的第IX组，表现出不同的组织特异性表达模式。研究人员在银白杨中构建了这四个ERF基因的过表达和敲除突变体。对转基因和突变株系的综合形态学和生理学鉴定表明，这些ERF基因参与了低温胁迫响应。该研究结果为进一步理解树木耐寒性的遗传基础提供了新见解。

在植物生长发育过程中，其持续遭受干旱、盐害和低温等多种非生物胁迫，其中低温胁迫对植物危害尤为严重。已有大量证据表明，低温胁迫可直接抑制光合途径、增加膜通透性、造成氧化损伤甚至导致细胞大规模死亡；也可间接诱导渗透arily渗透胁迫、氧化胁迫及其他有害效应。依据温度范围及相关生理机制，植物低温胁迫可分为冷害胁迫（0~20 °C）和冻害胁迫（<0 °C）。冷害可导致细胞骨架解聚、膜刚性增加、蛋白复合体去稳定化及酶活性降低；冻害则引起质外体冰晶形成，导致细胞脱水和膜破裂等不可逆损伤。近几十年来，全球变暖事件频发，使森林树木春季物候提前、休眠解除加速，导致其在休眠解除后更易遭受低温胁迫。新萌发嫩枝高度脆弱，其死亡会造成生物量产量严重损失；即使霜冻非致死性，反复冻害也会显著影响树木活力，春季霜冻还可通过损伤花芽、降低种子产量而对繁殖产生不利影响。据预测，未来几十年极端冬季和严酷春季等气候变化将加剧低温伤害导致的树木死亡。气候适应尤其是低温耐受性是北方树种关键的进化驱动力，因此阐明森林树木低温胁迫响应的分子机制对于理解其独特生存与进化策略至关重要。

为适应波动的环境温度，植物已进化出复杂的低温胁迫抵抗机制。许多植物在暴露于低温但非冰冻温度时可增强自身抗冻性，该现象称为冷驯化（cold acclimation）。植物通过一系列生理变化应对低温胁迫，包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）和过氧化物酶（peroxidase，POD）等抗氧化酶活性的改变，以及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量和膜通透性的增加——后者是细胞损伤的指标。这些效应由转录调控介导，其中CBF/DREB1（C-repeat binding factor/dehydration-responsive element-binding protein 1，C-重复结合因子/脱水响应元件结合蛋白1）依赖性转录调控途径是植物低温胁迫响应的主要途径。尽管CBF类基因对冻害耐受性至关重要，但独立于CBF途径调控植物低温响应的基因也已被鉴定。银白杨作为杨属（Populus）物种，广泛分布于北非、南欧和中亚，具有强抗病虫性和对干旱、盐害及低温等多种非生物胁迫的耐受性。在中国，银白杨主要分布于新疆额尔齐斯河流域，表现出卓越的抗冻性，可在-40 °C低温下存活，因此是研究杨树抗寒机制的理想模式材料。

研究人员对银白杨低温胁迫下的转录组进行了表征，鉴定了大量在根和叶组织中上调表达的基因。通过Mfuzz聚类和系统发育分析，四个低温响应ERF基因被鉴定出来。研究人员在银白杨中构建了这些基因的过表达和敲除突变体，证实其与低温胁迫响应相关，为森林树木耐寒性遗传基础提供了新见解。

研究所用的主要关键技术方法包括：对银白杨幼苗（约25 cm高）进行4 °C低温处理，在0、3、6、12、24、48小时及恢复0.5小时后分别采集根和叶组织样本，每个样本设置三个生物学重复；利用Illumina NovaSeq 6000平台进行转录组测序，使用fastp进行原始数据质控，HISAT2比对至银白杨基因组（v2.0），StringTie进行基因表达定量，以padj < 0.05且|log₂(Fold Change)| > 1为阈值筛选差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），并用Mfuzz进行软聚类分析；基于MAFFT比对、采用最大似然法（JTT模型，1000次bootstrap）构建AP2/ERF超家族系统发育树；通过农杆菌介导的叶盘转化法获得转基因过表达株系，同时利用CRISPR/Cas9系统构建基因敲除突变体；对转基因和突变体株系进行0 °C冷处理，测定SOD、POD、CAT酶活性及MDA、H₂O₂、超氧阴离子（O₂^•-）含量、ABTS自由基清除能力和相对电导率（relative electrical conductivity，REC）等生理生化指标。

**转录组分析与低温响应ERF基因的鉴定**：表型观察显示银白杨幼苗在低温胁迫及恢复期间未出现明显萎蔫、黄化或生长抑制。转录组测序获得超过5.81 Gb的高质量clean data，Q20百分比超过98.91%。与0小时对照相比，根和叶组织在5个低温胁迫时间点（3、6、12、24、48小时）分别鉴定出10,686和9,637个差异表达基因，其数量随胁迫时间延长而增加，48小时达峰值后恢复时下降；上调基因数量也呈相同趋势，48小时时根和叶分别有5,783和4,129个基因上调。通过Mfuzz模糊c均值聚类算法分析，根和叶组织的差异表达基因各分为4个簇，其中Cluster 4在连续低温胁迫期间持续上调、恢复时显著下调。根Cluster 4含1,260个membership值>0.95的基因，叶Cluster 4含1,574个。

**Cluster 4中响应低温胁迫的转录因子**：在根和叶Cluster 4的转录因子中，ERF家族均为最丰富的类型，各有17个成员。合并去重后获得23个独特的ERF转录因子。基于Nakano等的分类系统，银白杨132个ERF基因被分为12组；23个低温响应ERF基因分布于10个组中，第IX组（group IX）包含数量最多的ERF基因。与苹果中关键低温响应基因MdERF1B的联合系统发育分析显示，MdERF1B聚类于第IX组，提示该组可能参与低温胁迫响应。第IX组分为A、B两个分支，A分支含A1和A2两个亚分支；A1亚分支包含Poalb08G014580、Poalb11G003100、Poalb19G003000和Poalb10G006010四个低温响应基因，B分支包含Poalb10G006020和Poalb02G003690两个基因。经表达模式分析筛选，最终确定Poalb08G014580、Poalb11G003100、Poalb19G003000和Poalb10G006020四个基因进行后续功能研究，并依染色体位置分别命名为PoalbERF73、PoalbERF86、PoalbERF124和PoalbERF80。

**PoalbERF73/80/86/124基因的表达模式与亚细胞定位**：四个ERF基因在银白杨根、茎、叶和顶芽中均有表达，但呈现不同的组织特异性表达模式。PoalbERF73在叶片中表达最高、根中最低；PoalbERF80和PoalbERF86在根中表达最高；PoalbERF124在顶芽中表达最高、根中最低。亚细胞定位分析显示，四个ERF蛋白均仅定位于细胞核中，与DAPI共定位结果一致确认其核定位特性。

**PoalbERF73/80/86/124过表达与敲除突变体的构建及常温下形态特征**：研究人员成功获得各基因的过表达株系，表达量上调7.51至3,059.35倍。通过CRISPR/Cas9系统获得各基因的敲除突变体：poalberf73突变体3个（L11、L13、L27），poalberf80突变体3个（L19、L40、L47），poalberf86突变体2个（L11、L24），poalberf124突变体3个（L1、L10、L51）。所有突变体均携带双等位基因突变，包括移码突变导致提前终止翻译、缺失保守AP2结构域等类型。常温下，除部分PoalbERF86和PoalbERF124相关株系的株高或地径与野生型存在差异外，多数转基因和突变体株系的形态指标与野生型无显著差异。

**PoalbERF73/80/86/124过表达与敲除株系的低温胁迫形态及生理特征**：

*PoalbERF73*：低温处理25天后，所有poalberf73敲除突变体均出现寒害症状，包括茎尖下垂、叶片黄化和严重萎蔫；而过表达株系与野生型无显著形态差异。生理指标显示，所有敲除突变体的SOD、POD和CAT活性均显著低于野生型；过表达株系与野生型无显著差异。过表达株系L38和L40的H₂O₂含量显著低于野生型；敲除突变体L27的O₂^•-含量显著升高。敲除突变体L11和L27的MDA含量显著高于野生型。所有敲除突变体的REC显著高于野生型；过表达株系L40和L41的REC也显著高于野生型。所有敲除突变体的ABTS自由基清除能力显著低于野生型；过表达株系L38的ABTS自由基清除能力同样显著低于野生型。

*PoalbERF80*：低温处理8天后，所有poalberf80敲除突变体出现寒害症状（茎尖下垂 attackments下垂）；过表达株系与野生型无显著形态差异。所有敲除突变体的SOD和POD活性显著低于野生型；过表达株系L23和L56的SOD活性以及L23的POD活性显著高于野生型，L23的CAT活性也显著高于野生型。所有敲除突变体的H₂O₂和O₂^•-含量显著高于野生型；所有过表达株系的H₂O₂含量显著低于野生型。所有敲除突变体的REC显著高于野生型；过表达株系与野生型无显著差异。敲除突变体L40和L47的ABTS自由基清除能力显著低于野生型。

*PoalbERF86*：低温处理19天后，所有poalberf86敲除突变体出现寒害症状（茎尖下垂）；过表达株系与野生型无显著形态差异。所有敲除突变体的SOD、POD和CAT活性均显著低于野生型；过表达株系与野生型无显著差异。所有敲除突变体的H₂O₂含量显著高于野生型；O₂^•-含量无显著差异。所有敲除突变体的REC显著高于野生型；过表达株系L36的REC也显著高于野生型。所有敲除突变体的ABTS自由基清除能力显著低于野生型；过表达株系L39的ABTS自由基清除能力同样显著低于野生型。

*PoalbERF124*：低温处理25天后，所有poalberf124敲除突变体出现寒害症状（茎尖下垂、叶片黄化和严重萎蔫）；过表达株系与野生型无显著形态差异。所有敲除突变体的SOD、POD和CAT活性均显著低于野生型；过表达株系L85和L101的SOD活性以及L101的CAT活性显著高于野生型。敲除突变体L10和L51的H₂O₂含量显著高于野生型；MDA含量无显著差异。所有敲除突变体的REC显著高于野生型；过表达株系L85的REC显著低于野生型。敲除突变体L1和L51的ABTS自由基清除能力显著低于野生型。

在讨论部分，研究人员指出植物通过多样化的机制应对非生物和生物胁迫，而基因调控网络在其中发挥关键作用。转录因子是改良农作物和林木农艺性状的首选候选靶点。AP2/ERF超家族是植物中最大的超家族之一，参与发育及生物和非生物胁迫响应。该研究中，根和叶低温响应转录因子中ERF家族均为最丰富的类型，与以往研究结果一致，提示ERF家族基因可能有助于低温耐受性。

银白杨基因组含132个ERF基因，依据Nakano等的分类系统分为12组，其中第IX组含29个成员，数量最多。有趣的是，许多与抗非生物胁迫相关的ERF基因聚类于该组，如苹果MdERF1B。该研究中四个低温响应ERF基因均属于第IX组，其敲除突变体均表现出寒害敏感性，进一步支持第IX组是参与低温胁迫的ERF基因群组。

研究人员利用CRISPR/Cas9系统构建了四个ERF基因的敲除突变体。PoalbERF80突变体双等位基因均携带移码突变，导致提前终止翻译和完整AP2保守结构域（DNA结合结构域）的缺失；PoalbERF73突变体L27、PoalbERF86突变体L11和PoalbERF124突变体L51的双等位基因也均携带移码突变，导致提前终止翻译和保守AP2结构域的丧失。这些突变体均表现出对低温的敏感性，提示突变可能破坏了这些基因的功能。此外，另五个突变体的一个等位基因携带移码突变导致提前终止翻译和保守AP2结构域丢失，另一等位基因仅少量氨基酸缺失；这些突变体不仅表现出低温敏感，且生理生化参数与双等位基因缺失突变体相似，表明基因编辑导致这些ERF基因功能受损或丧失。

四个ERF基因敲除后，所有突变体在低温下均表现出一致的形态和生理变化，表明这些基因参与低温胁迫响应。相比之下，过表达这些基因时，所有转基因株系在低温下与野生型无显著形态差异，仅表现出适度的生理变化。研究人员提出两种可能的解释：一是在0 °C处理条件下，银白杨内源表达水平可能已足以完全激活下游低温响应靶基因，由于途径饱和，额外过表达可能无法进一步增强低温响应，在更严重低温下过表达株系可能表现出增强的耐寒性；二是这四个ERF基因可能需与其他辅助因子协同作用增强耐寒性，若需形成复合体发挥作用，单纯增加ERF转录本丰度可能不足以实现预期功能结果。

低温导致植物氧化应激加剧，由活性氧（reactive oxygen工作后，oxygen species，ROS）过量产生引起。ROS过量积累损伤膜脂质、蛋白质和核酸，最终导致细胞死亡。SOD将O₂^•-转化为H₂O₂，CAT进一步将H₂O₂分解为水和氧气，从而防止ROS积累及其导致的蛋白质氧化、脂质过氧化和DNA损伤。低温下，所有敲除突变体的SOD和POD活性均显著降低，CAT活性除PoalbERF80外也降低，表明PoalbERF73/80/86/124在维持低温期间正常抗氧化酶活性方面发挥作用。

低温改变细胞膜的选择透过性，导致电解质外渗和REC增加，REC可反映低温下细胞膜损伤程度。该研究中所有敲除突变体的REC均显著高于野生型，表明敲除增加了低温下的细胞膜损伤。H₂2₂O₂含量均显著升高；而所有PoalbERF80过表达株系以及PoalbERF73过表达株系L38和L40的H₂2₂O₂积累中起重要作用，而PoalbERF73和PoalbERF80在增强H₂O₂清除方面发挥积极作用。ABTS自由基清除能力反映植物抗氧化潜力，除PoalbERF80突变体L19和PoalbERF124突变体L10外，所有敲除突变体的ABTS自由基清除能力均显著低于野生型，表明这些突变体的抗氧化能力受损。这些结果综合表明四个ERF基因有助于银白杨的低温胁迫耐受性。

研究人员也讨论了统计方法和实验设计的局限性。研究采用单因素方差分析或Kruskal-Wallis检验，将每个转基因株系独立与野生型比较，虽在植物转基因研究中常见且考虑了株系特异性插入效应，但无法完全消除来自同一构建体的多个株系导致的伪重复风险。混合效应模型将构建体作为固定因子、株系嵌套于构建体作为随机因子，可提供更稳健的统计效力，但因部分构建体独立株系数量较少（如PoalbERF86敲除突变体仅2个）而受限。此外，部分PoalbERF73和PoalbERF86过表达株系在低温下表现出与相应敲除突变体相似的生理变化，可能与T-DNA插入位点直接或间接干扰了某些参与ABTS自由基清除或膜完整性维持基因的表达有关，但该解释缺乏实验验证，尚属推测。

最后，研究人员指出敲除植株出现寒害症状时，野生型和过表达株系均未出现形态寒害症状，且所有植株同步用于生理生化的重要性—生理生化参数测定，由于敲除植株已处于寒害状态，所测参数反映了低温下的生理响应。然而对于敲除植株而言，这些变化可能是基因敲除的直接结果或是寒害的次级效应。未来需在敲除植株出现寒害症状前的多个时间点测定参数，以更清楚地阐明这些ERF基因在低温响应中的调控功能。

基于转录组分析，研究结论认为：研究人员鉴定了银白杨中四个响应低温胁迫的ERF基因（PoalbERF73/80/86/124），这四个基因属于ERF家族第IX组，具有不同的组织特异性表达模式。功能验证表明，敲除任一基因均显著增加冷敏感性，表现为寒害加重、抗氧化酶活性降低和膜损伤增强。这些结果表明四个基因有助于低温耐受性。该发现为森林树木耐寒性的遗传基础提供了新的深入见解。