结合T-DNA与CRISPR/Cas9突变技术揭示了拟南芥BAG家族的冗余发育功能

《Plant Science》：Combined T-DNA and CRISPR/Cas9 mutagenesis reveals redundant developmental roles of the Arabidopsis BAG family

　　邵德义|文新宇|罗琼|刘秀萍|李璐华|门淑珍中国天津南开大学生命科学学院植物生物学与生态学系，天津蛋白质科学重点实验室，邮编300071摘要BAG（Bcl-2相关凋亡基因）基因编码具有进化保守性的共伴侣蛋白，参与蛋白质稳态调控、应激反应以及程序性细胞死亡。然而，它们在植物发育过程中的整体功能仍不明确。通过对拟南芥BAG基因启动子中的顺式元件分析，发现其中存在多个激素响应元件，这表明BAG基因可能参与植物激素介导的发育调控。为探究这一现象，我们利用T-DNA插入突变体与CRISPR/Cas9介导的突变技术，构建了同时敲除七个拟南芥BAG基因的bag-septuple（bag-s）突变体。表型分析显示该突变体存在多种缺陷，包括种子萌发延迟、种皮粘液积累增加、主根伸长受阻、莲座叶直径和植株高度降低以及叶片衰老延迟。与叶片衰老延迟的表型一致，bag-s突变体中与衰老相关的基因及促进衰老的转录因子表达均下降。RT-qPCR分析进一步表明，该突变体中参与生长素生物合成和信号传导的基因表达也有所降低。此外，外源IAA可部分恢复bag-s突变体的主根伸长缺陷，这说明BAG基因与依赖生长素的根系生长之间存在功能关联。综上，这些研究结果表明BAG基因在种子萌发、营养生长、与生长素相关的根系发育以及叶片衰老过程中发挥冗余调控作用，为进一步解析BAG基因在蛋白质稳态、激素信号传导及植物发育之间的协调机制提供了遗传学基础。引言植物的生长与发育是由内在遗传程序与环境信号相互作用所调控的复杂动态过程（Zhu等，2025）。从种子萌发和根系建立到地上器官的形态形成，每个发育阶段都需要多个基因网络和植物激素信号通路的协同调控（Kabbage和Dickman，2008；Xu等，2023；Zhu等，2023）。先前的研究表明，脱落酸信号通路中的关键转录因子ABI5，以及丝裂原活化蛋白激酶MPK3和MPK6，在调控种子休眠和维持根尖分生组织稳态方面起着核心作用（Hu等，2019；Zhao等，2020；Liu等，2024）。此外，KNOX1和BOP基因家族的成员对节间发育及整个植物的结构也至关重要（Ejaz等，2021；Tsuda等，2024）。因此，系统地解析植物生长与发育的分子机制，不仅能加深我们对基本发育规律的理解，还能为通过分子育种和生物技术手段改良作物提供理论依据。BAG（Bcl-2相关凋亡基因）基因家族在真核生物中具有进化保守性，编码多种功能的共伴侣蛋白，参与包括生长、发育、程序性细胞死亡以及应激反应在内的多种生物过程（Takayama等，1995；Kabbage和Dickman，2008；Yang等，2022；Sheehan等，2023；Singh等，2024）。所有BAG蛋白都含有一个保守的BAG结构域，该结构域可与Hsp70/Hsc70家族的分子伴侣相互作用，调节其ATP酶活性，从而参与蛋白质稳态维持、与细胞凋亡相关的过程以及蛋白质降解途径（Kumar等，2014；Hoang等，2015；Lee等，2016；Gayral等，2020）。越来越多的证据表明，植物BAG家族成员在非生物和生物胁迫响应中发挥着重要作用。AtBAG4和AtBAG7可帮助植物抵御多种非生物胁迫（Kang等，2006；Hoang等，2015），而AtBAG6则在病原体感染和环境胁迫条件下调控程序性细胞死亡（Williams等，2010）。最新研究还发现，BAG3作为一种保守的免疫调节因子，可将髓过氧化物酶激活与抗病毒免疫联系起来。在番茄斑萎病毒感染时，髓过氧化物酶MC4会切割BAG3，释放其N端结构域，该结构域会聚集成寡聚体并诱导细胞死亡，从而限制病毒复制（Liang等，2025）。此外，BAG2和BAG6会在盐分、渗透压和热胁迫下被诱导表达，而bag2、bag6以及bag2 bag6突变体对ABA、干旱和热胁迫的反应会发生改变，这表明这两种BAG蛋白可调控拟南芥的非生物胁迫耐受性（Arif等，2021）。在番茄中，BAG2已被证实能与MAPK2相互作用，这两种蛋白以时间依赖的方式调控热诱导的程序性细胞死亡。BAG2和MAPK2可抑制短期（3小时）热诱导的PCD，但能促进长期（24小时）热诱导的PCD，这说明BAG蛋白对细胞死亡的影响取决于胁迫持续时间（He等，2024）。此外，HsfA1a–BAG2/BAG5b模块可通过增强HsfA1a介导的热休克蛋白基因转录激活来提高耐热性，这表明BAG蛋白也可能参与热胁迫响应中的转录调控网络（He等，2025）。在拟南芥中已阐明了BAG蛋白介导的耐热机制。一种定位于内质网的共伴侣蛋白AtBAG7在热胁迫下会发生苏素化及蛋白水解切割，随后从内质网转移至细胞核，并与转录因子WRKY29相互作用，从而提升植物的耐热性（Li等，2017）。越来越多的证据表明，植物BAG蛋白在发育过程中也发挥着重要作用。在拟南芥中，AtBAG5定位于线粒体，可与CaM/BAG5/Hsc70信号复合物相互作用，从而促进叶片衰老。在细胞质钙离子浓度较低时，无钙调蛋白会结合AtBAG5的IQ结构域，但不影响Hsc70与BAG结构域的结合，进而促使活性氧积累以及SAG12和SEN4等与衰老相关的基因表达。当钙离子浓度升高时，饱和钙调蛋白会改变其与AtBAG5的结合方式，打破AtBAG5与Hsc70的相互作用，导致Hsc70释放，进而抑制叶片衰老。因此，AtBAG5可作为钙离子敏感的分子枢纽，将钙信号转化为通过共伴侣蛋白实现的衰老调控（Li等，2016）。在烟草中，BAG5的同源基因NtBAG5c可与HSP70和sHSP20相互作用，沉默该基因可降低木质素含量，提高SOD活性，并减少过氧化氢的积累，从而延缓叶片衰老。NtBAG5c还可上调NtCP1、SEN4和SAG12等与衰老相关的基因表达（Gu等，2023）。这些研究结果表明，BAG5蛋白可能在不同植物物种中作为调控叶片衰老的保守正向因子。在二倍体草莓中，BAG6-A可与S-RNase直接相互作用，调控配子体的发育；其过表达会导致活性氧积累增加，花药和花粉母细胞的过早降解，进而引发花粉和胚珠的败育，这说明BAG蛋白可能通过调控活性氧稳态和泛素相关途径来影响雄性和雌性配子体的发育（Zhao等，2023）。尽管先前的研究已经明确了单个BAG蛋白在应激响应、程序性细胞死亡及发育过程中的重要作用，但拟南芥BAG家族在植物生长与发育过程中的整体功能仍不十分清楚。造成这一现象的部分原因是家族成员之间存在潜在的功能冗余，这可能会掩盖单基因或低阶突变体的发育表型，从而限制对家族整体功能的分析。尤其是，目前尚不清楚拟南芥BAG基因是否在种子萌发、营养生长及叶片衰老等关键发育过程中发挥冗余调控作用，以及这些功能是否与生长素信号传导等激素调控途径有关。为阐明拟南芥BAG基因的家族级发育功能，我们构建了同时敲除七个BAG基因的bag-septuple（bag-s）突变体。该突变体是在bag4 bag5 bag6三重突变体背景的基础上，通过CRISPR/Cas9技术对剩余的四个BAG基因（BAG1、BAG2、BAG3和BAG7）进行多重突变获得的。利用该突变体，我们研究了家族级BAG基因功能缺失对种子萌发、营养生长及叶片衰老的影响，检测了参与生长素生物合成、信号传导及衰老过程的基因表达情况，同时还测试了外源IAA是否能恢复bag-s突变体的主根表型。我们的研究结果揭示了BAG家族的冗余发育功能，为理解BAG基因在植物发育中的调控作用提供了遗传学基础。材料与方法植物材料及培养条件拟南芥BAG家族的T-DNA插入单突变体bag2（SALK_030295）、bag5（SALK_037369）和bag6（SALK_004760）此前已有报道（Li等，2016；Arif等，2021）。其余突变体bag1（SALK_017591）、bag4（SAIL_144_A10）和bag7（SALK_065883）则从拟南芥生物资源中心获取（ABRC；https://abrc.osu.edu/）。用于检测这些T-DNA插入突变体的所有引物均列于补充表S1中。bag3突变体则……拟南芥BAG家族的系统发育与启动子分析据报道，拟南芥BAG家族成员在非生物胁迫响应（Yan等，2003；Williams等，2010；Kumar等，2014）、程序性细胞死亡（Doukhanina等，2006）以及植物生长与发育（Li等，2016）过程中发挥着重要作用。为系统研究该家族的进化关系及其在发育调控中的作用，我们首先对七个拟南芥BAG蛋白进行了多序列比对……讨论BAG家族包含具有进化保守性的共伴侣蛋白，这类蛋白可将分子伴侣的活性与细胞稳态、应激响应、程序性细胞死亡及发育调控联系起来（Takayama等，1995；Kabbage和Dickman，2008；Doukhanina等，2006）。在拟南芥中，BAG蛋白在结构上具有多样性，不同的成员含有不同的功能结构域，包括类泛素结构域或钙调蛋白结合结构域，这表明它们可能……未引用参考文献（Zhang等，2023）CRediT作者贡献说明李璐华：资源提供、概念设计。门淑珍：写作——审稿与编辑、监督、资金获取、概念设计。罗琼：资源提供、实验研究、概念设计。刘秀萍：验证、实验研究。邵德义：写作——审稿与编辑、初稿撰写、可视化处理、实验研究、数据整理、概念设计。文新宇：验证、定量分析、数据整理。利益冲突声明作者声明不存在任何可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。致谢本研究得到了中国国家自然科学基金的支持（项目编号31870230、32070281和32370271，资助人为S.M.）。利益冲突声明作者声明不存在任何利益冲突。