基于血液的环状核糖核酸用于阿尔茨海默病的早期诊断

《Nature Medicine》：Blood-based circular RNAs for early diagnosis of Alzheimer’s disease

　　

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）临床症状出现之前的检测对于新治疗方法的应用至关重要。环状核糖核酸（circular RNAs, circRNAs）是高度稳定的非编码核糖核酸（non-coding RNAs），在脑组织中富集，且能够跨越血脑屏障（blood–brain barrier）。本研究分析了来自1,221名AD患者和健康个体的血液数据，鉴定出34个与AD状态相关的circRNAs。包含这34个circRNAs的预测模型在基于生物标志物确认（淀粉样蛋白-β和Tau）的AD分类中与血浆磷酸化Tau-217（phosphorylated Tau-217, pTau217）相当，并在来自Knight-阿尔茨海默病研究中心（Knight-Alzheimer Disease Research Center）（n=551：76例AD，475例认知功能未受损者）和临床前A4队列（n=1,767）的独立样本中得到验证。血液circRNAs对生物标志物确认状态的分类（曲线下面积（area under the curve, AUC）=0.945）具有比血浆pTau217（AUC=0.877）更高的预测能力，且在整合模型中进一步提高（circRNA+pTau217 AUC=0.977）。该模型对AD具有高特异性，但对帕金森病、额颞叶痴呆及其他神经退行性疾病的预测能力较低。在Knight-阿尔茨海默病研究中心发现队列中，这些circRNAs（风险比（hazard ratio）=2.92）在预测向症状性AD进展方面优于pTau217（风险比=1.81）和淀粉样蛋白-正电子发射断层扫描（amyloid-positron emission tomography）。尽管需要在更大队列中进行前瞻性验证，但这些结果表明血液circRNAs可作为AD诊断和疾病进展的潜在生物标志物。

## 研究背景与问题提出

阿尔茨海默病（AD）是痴呆的首要病因，其病理特征为脑内淀粉样蛋白-β（Aβ）和Tau蛋白异常聚集，伴随突触功能障碍和神经元死亡。AD的病理改变在认知衰退之前数十年即已发生，因此在认知功能未受损（cognitively unimpaired, CU）个体中检测AD病理，可能为延缓或阻止不可逆神经退行性变的干预措施提供时机。传统的生物标志物确认诊断依赖于脑脊液（cerebrospinal fluid, CSF）中的Aβ、Tau和磷酸化Tau（phosphorylated Tau, pTau）检测，或通过淀粉样蛋白-正电子发射断层扫描（amyloid-positron emission tomography, PET）成像，但腰椎穿刺采集CSF具有侵入性，PET检查费用昂贵。当前，血浆pTau217等血液生物标志物发展迅速，其与淀粉样蛋白病理强相关，且在抗淀粉样蛋白治疗后可能随脑内Aβ斑块清除而正常化，限制了其监测临床症状的能力。因此，需要能够反映整体疾病状态和症状学的额外生物标志物，以检测临床AD并在抗淀粉样蛋白治疗新时代监测神经退行性变。环状核糖核酸（circRNAs）是高稳定性的单链RNA，通过反向剪接使3′端与5′端连接形成共价闭合环，其半衰期为线性RNA的两倍，能够跨越血脑屏障，且在脑组织中高表达。既往研究虽在AD患者脑组织和血液中发现了差异表达的circRNAs，但样本量小、缺乏对疾病进展的预测能力验证，且未与其他血液生物标志物整合。研究人员推测，鉴定能够区分症状性AD患者与CU个体的血液circRNAs，可能为AD诊断提供新型非侵入性生物标志物。

## 主要技术方法

研究人员采用了一项大型横断面血液样本研究设计，主要技术方法包括：基于Knight-Alzheimer Disease Research Center（ADRC）的1,221例样本（405例AD，816例CU）作为发现队列，结合Knight-ADRC独立样本（n=551）和Anti-Amyloid Treatment in Asymptomatic Alzheimer Disease（A4）队列（n=1,767）进行验证；利用DCC、CIRI2和CIRI三种生物信息学工具进行circRNA鉴定与定量；采用负二项分布逻辑回归进行差异表达分析；构建逻辑回归和Cox比例风险模型评估诊断和预测性能；通过受试者工作特征曲线下面积（AUC）、风险比（hazard ratio, HR）等指标评价模型效能；利用CircAtlas 3.0数据库和实时定量PCR（qPCR）分析circRNA的组织表达谱；采用主成分分析（PCA）推断遗传祖先背景。

## 研究结果

### 34个血液circRNAs的鉴定与验证

研究人员分析了Knight-ADRC队列中1,601个通过严格质控的circRNAs，发现203个circRNAs与临床AD状态名义上显著相关（P<0.05），其中35个经假发现率（false discovery rate, FDR）校正后仍显著，包括circDNAJC₆（P=1.88×10^?8）、circMocated 2（P=3.80×10^?4）和circPICALM（P=1.23×10^?3）。敏感性分析显示，34个circRNAs在CIRI2和CIRI3中保持稳定，效应量高度相关（DCC与CIRI2的R²=0.78，P<0.001；与CIRI3的R²=0.84，P<0.001）。30个circRNAs在脑组织表达中排名位于第80百分位以上，14/21个经qPCR验证的circRNAs在脑中高表达。87%（29/33）的circRNAs与其线性mRNA的关联相互独立。

### AD诊断准确性

34个circRNA模型在生物标志物确认状态（A^?T^? vs A⁺T⁺）分类中AUC达0.945，高于血浆pTau217（AUC=0.877），整合模型AUC达0.967。该模型在淀粉样蛋白-PET阳性预测中AUC为0.757，与pTau217整合后提升至0.931。性别分层分析显示女性AUC=0.903、男性AUC=0.909；APOE4分层分析中，APOE4^?个体AUC=0.856，APOE4⁺个体AUC=0.883。跨祖先验证显示，欧洲裔（AUC=0.906）、非洲裔（AUC=0.934）和混合 ancestry（AUC=0.922）均表现稳健。

### AD特异性验证

34-circRNA模型在非AD神经退行性疾病中预测能力低下：帕金森病（PD）AUC=0.413、路易体痴呆（DLB）AUC=0.545、额颞叶痴呆（FTD）AUC=0.404。仅3个circRNAs（circRBM₂₃、circEPB₄₁和circNUP₅₄）在所有神经退行性疾病中名义上显著，提示模型整体具有AD特异性。

### 症状性AD进展预测

在78例由CU进展至症状性AD的参与者中，circRNA模型的HR=2.92（95%置信区间（confidence interval, CI）1.63–5.23），显著高于pTau217（HR=1.81，95% CI 1.11–2.94；P=0.002）。5年内进展预测中，circRNA模型AUC=0.870，显著优于pTau217（AUC=0.676；P=1.86×10^?5）。整合模型区分双阳性（circRNA⁺/pTau217⁺）与双阴性（circRNA^?/pTau217^?）参与者，84%双阳性者进展至AD，仅15%双阴性者进展。生存分析显示circRNA水平在临床症状出现前2–4年即开始变化。

### 独立队列验证

Knight-ADRC复制队列中，circRNA模型对生物标志物确认状态的AUC=0.863，整合pTau217后AUC=0.955；进展预测HR=3.83，整合后HR=13.95。A4队列中，circRNA模型对生物标志物状态的AUC=0.723，进展预测HR=2.93，整合pTau217后HR=4.58，三个队列结果一致。

## 讨论与结论

研究人员指出，circRNAs因其高稳定性、组织特异性调控和跨越血脑屏障的能力，成为疾病状态预测的新型候选分子。本研究鉴定了34个与生物标志物确认AD状态及症状性AD进展相关的血液circRNAs，其在Knight-ADRC复制队列和A4独立队列中的验证表明，该模型在预测症状性AD进展方面显著优于血浆pTau217。

既往circRNA研究多集中于脑组织，而本研究利用大规模血液样本弥补了该领域空白。与仅追踪淀粉样蛋白病理的pTau217不同，34个circRNAs似乎捕获了超越病理学的整体AD疾病生物学特征，部分circRNAs的宿主基因涉及突触功能调控（如circDNAJC₆），PICALM来源的circRNAs与Aβ、Tau、APOE4功能、突触功能障碍及小胶质细胞衍生神经炎症相关。整合circRNA与pTau217模型能够区分非进展者、中等风险进展者和高风险进展者，为临床试验参与者的分层提供了新工具。

研究亦存在局限：时间至发病（time to onset, TTO）分组的样本量较小；临床痴呆评定量表（Clinical Dementia Rating, CDR）数据主要集中于0或0.5分；虽然多数circRNAs在脑组织中高表达，但尚不能证明血液中的circRNAs直接来源于脑；3个circRNAs与其他神经退行性疾病存在关联，提示病理重叠。鉴于血浆pTau217在抗淀粉样蛋白治疗中可能随病理清除而变化的局限性，血液circRNAs作为独立于Aβ和Tau病理的生物标志物，在监测整体神经退行性变方面具有独特价值。

**研究结论**：34个血液circRNAs模型在AD诊断中展现出与当前标准方法相当甚至更高的准确性，且在预测症状性AD进展方面优于血浆pTau217，整合模型进一步提升了预测效能。这些circRNAs在临床症状出现前2–4年即发生变化，表明其能够捕捉疾病动态进展信号。经过大型前瞻性队列验证后，血液circRNA模型有望推进AD的早期检测和进展监测，成为非侵入性、可规模化应用的新型生物标志物工具。