固有免疫应答能力预测受控人类流感感染后的增强性细胞免疫及症状性疾病

《Nature Medicine》：Innate immune responsiveness predicts enhanced cellular immunity and symptomatic disease after controlled human influenza infection

　　

摘要：受控人类流感感染研究（Controlled Human Infection Studies, CHI）可独特地探究与临床结局相关的早期免疫因子。本研究纳入27名低毒株特异性血清中和抗体水平的健康志愿者，经甲型流感病毒A/H3N2攻击后，22人发生感染（其中18人出现轻至中度症状，4人为无症状感染）。局部及全身免疫谱分析显示，有症状受试者体内固有免疫通路被更早且更强地激活；单核细胞（monocyte）和树突状细胞（dendritic cell, DC）的早期活化与更高症状评分相关，但也随之伴随更强的自然杀伤（natural killer, NK）细胞及CD8+T细胞活化。基线时，有症状受试者的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）对体外病毒刺激表现出更高反应性，表明个体在病毒暴露时已存在倾向于不同免疫转归的固有免疫特质，且该特质在感染后被进一步调节。结果表明，人类固有免疫细胞反应性是症状性疾病及已知可促进病毒清除的细胞免疫应答的共同前置决定因素，若能将二者解耦可为治疗干预提供潜在靶点。

本文发表于《Nature Medicine》，研究围绕"为何相同流感病毒感染会导致部分人出现症状而另一部分人无症状"这一未解问题展开。既往观察性研究提示重症流感与过度炎症反应（高细胞因子血症）有关，但相同病毒下个体差异的原因不明；此外，前期研究多无法捕捉感染极早期的固有免疫动力学变化。本研究利用受控人类流感感染（Controlled Human Influenza Infection, CHI）模型，在严格质控下纵向采集同一批健康成人感染前后的多维度免疫数据，旨在揭示早期固有免疫特征如何同时决定症状发生与后续适应性免疫强度。

主要关键技术方法

研究人员招募30名18–55岁、针对流行株A/Belgium/4217/2015(H3N2)血清微量中和抗体滴度≤1:20的健康成人（最终分析n=27，排除3人），经鼻接种5×10⁵TCID₅₀病毒，隔离观察至第10天并随访至第180天，每日记录改良Jackson症状评分并采集鼻灌洗液与外周血。采用qPCR检测鼻灌洗液中流感病毒M基因定量病毒载量（Viral Load, VL）；全血及下鼻甲黏膜组织进行RNA测序（RNA-seq）行差异表达基因（Differentially Expressed Gene, DEG）与IPA通路分析；血浆及鼻吸出液用Meso Scale Discovery（MSD）多重试剂盒检测可溶性介质；流式细胞术（Flow Cytometry）分析单核细胞亚群〔经典单核细胞（Classical Monocyte, CM）CD14⁺CD16^?、中间型单核细胞（Intermediate Monocyte, IM）CD14⁺CD16⁺、非经典单核细胞（Non-classical Monocyte, NCM）CD14^dimCD16⁺〕、树突状细胞亚群〔浆细胞样DC（plasmacytoid DC, pDC）CD123⁺、cDC1 CD11c⁺CD141⁺、cDC2 CD11c⁺CD1c⁺〕、NK细胞及CD4⁺/CD8⁺T细胞表型与活化/增殖标志物（CD169/Siglec-1、HLA-ABC、HLA-DR、CD38、Ki-67等）；基线及感染后第14、28天PBMC做灭活病毒及TLR配体体外刺激并测上清细胞因子；用maSigPro做时间序列基因聚类、MEFISTO做多模态时间降维、向量自回归（Vector Autoregression, VAR）框架推断免疫特征间时序依赖关系。

研究结果

Viral load fails to explain asymptomatic infection in influenza A/H3N2-inoculated volunteers（接种A/H3N2流感病毒的志愿者中病毒载量无法解释无症状感染）

27人中22人PCR确诊感染（18例有症状，4例无症状，5例未感染）。有症状组VL与症状均在第4天达峰，无症状组VL在第3天达峰但全程近零症状，两组急性期VL无显著差异，但有症状组第8天VL显著更低（P=0.026），提示症状差异并非由病毒复制量不同导致。

Symptomatic infection is associated with early innate transcriptional changes（症状性感染伴早期固有免疫转录改变）

配对及maSigPro时间序列分析发现，感染后有症状者血液于第2–3天即出现大量DEG富集于Ⅰ型干扰素信号、TLR通路、NF-κB等固有免疫/促炎通路，早于且强于无症状者；鼻腔黏膜转录响应较血液延迟，同样在有症状者中更显著且持续至第7天。Cluster 2（Ⅰ型干扰素刺激基因ISG富集）急性期AUC与症状评分正相关。

Soluble mediators are induced earlier and to higher levels in symptomatic participants（有症状受试者可溶性介质诱导更早且水平更高）

血浆中IFNγ、IL-6（第2天）、IFNα2a、TNF、IL-10（第3天）在有症状组显著升高并呈双相峰值；鼻腔中IL-6、IL-15间歇性更高，但IL-10、CCL13、CCL22在无症状组鼻腔中更高，提示局部抗炎/趋化因子可能与无症状保护相关。

Symptoms are associated with early myeloid activation and antigen cross-presenting capacity（症状与早期髓系细胞活化及抗原交叉呈递能力相关）

流式显示有症状者感染后总单核细胞、中间型单核细胞（IM）比例及NCM比例升高更早更明显，pDC频率亦增加；所有单核/DC亚群表面CD169（Siglec-1）、HLA-ABC、CD40/CD86上调幅度更大且更快。第3–4天IM百分比及CD169、HLA-ABC平均荧光强度（Median Fluorescence Intensity, MFI）与症状评分显著正相关。

Natural killer and CD8⁺T cell proliferation correlates with early systemic innate cell activation（NK及CD8⁺T细胞增殖与早期全身固有细胞活化相关）

第7天有症状组CD56^dimNK及CD8⁺T细胞中Ki-67⁺活化/增殖亚群频率显著更高，CD38⁺Ki-67⁺CD8⁺T细胞及CD56^dimKi-67⁺NK细胞频率与第3–4天IM百分比及单核/DC上CD169、HLA-ABC MFI显著正相关，提示强早期固有活化驱动后续更强适应性免疫效应。基线流感肽池特异性IFNγ ELISpot在组间无差异且与症状/VL无关。

Integrative analyses reveal temporal dependencies across anatomical sites and immune modalities（整合分析揭示跨解剖部位与免疫模态的时序依赖）

分段混合效应及相关分析示VL生长率与最高症状评分相关，鼻黏膜IFNγ激活时间与VL生长率/峰值负相关。MEFISTO提取四因子，Factor 1（症状vs无症状差异最大）含早期鼻黏膜抗病毒基因及血液增殖基因。VAR模型示血液VL正向预测CXCL10、IFNγ、TNF；鼻VL正向预测IFNλ1、IFNα2a、CCL3/4；血液IM频率预测NCM及后续NK活化，NK活化负向关联VL；鼻IL-15由VL/症状预测并负向预测VL/症状，形成IL-15介导的负反馈回路促进NK清除病毒。

Susceptibility to symptomatic influenza is associated with greater pre-infection responsiveness to innate stimulation（对症状性流感的易感性关联于感染前更高的固有刺激反应性）

基线PBMC经热灭活（heat-inactivated, HI）A/H3N2病毒刺激24 h，将有症状者上清IL-1β显著高于无症状者（P<0.05），TNF、IL-6等有相同趋势；主要产生细胞为经典及中间型单核细胞。感染第14天同法刺激PBMC呈普遍低分泌（重编程/低反应性），第28天恢复。基线体外PBMC分泌与体内急性早期（第3天）介质变化呈负相关，说明固有细胞敏感性受近期暴露调控。

讨论部分总结（结论翻译）

本研究表明，受控人类流感感染后，早期固有免疫应答的速度与幅度对疾病具有双重影响——既促进感染清除又引起症状。尽管受试者均为健康青年且低中和抗体，病毒暴露时固有免疫细胞反应性差异已预示个体将走向症状性或无症状感染，该差异随后被感染信号放大。症状评分差异不能由病毒载量解释，而与干扰素驱动的转录上调程度相关，此为呼吸道病毒感染特征。血液转录响应快于鼻腔黏膜，循环活化的髓系细胞可能是主要贡献者。有症状者早期可溶性介质（含CXCL10为连接局部与全身的中心节点）更快更高升，与后期症状评分具时序因果关系。无症状感染关联鼻腔较早/较高水平IL-10、CCL13、CCL22。中间型单核细胞增多及单核/DC上CD169、HLA-ABC上调是症状严重度标志，并与后续更强的NK及CD8⁺T细胞活化/增殖相关，提示强早期固有活化通过增强DC/单核细胞交叉呈递促进细胞免疫。固有反应性可受表观遗传训练免疫或近期暴露调节——本研究发现感染2周后PBMC呈短暂低反应性，支持固有细胞可被正向或负向调控。人群局限为无症状例数少（n=4），但通过纵向统计与多模态整合增强说服力；结果外推至重症流感需谨慎。若将增强疫苗诱导适应性免疫的强固有启动（如强佐剂）与致炎性不良反应解耦，有望优化防治策略。综上，人类固有免疫细胞反应性是症状性疾病及促病毒清除的细胞免疫共同前置决定因素，早期固有免疫平衡微调对流感转归至关重要，可为宿主导向诊断、鼻用疫苗及免疫调节疗法提供依据。