利用在线分段多维液相色谱-串联质谱技术，更精准地检测难处理的根及根茎类中药材中的85种霉菌毒素

《Talanta》：Enhanced determination of 85 mycotoxins in challenging root and rhizome herbal medicines using online segmented multi-dimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry

　　潘慧琴|徐静|秦晓雅|谭彦楠|陈玲|冯睿|曹一民|陈苏云|沈吉|胡青|周恒
中国上海，上海药物控制研究所，国家药品监督管理局监管科学创新研究中心

**摘要**
准确灵敏地检测霉菌毒素污染对于确保草药的安全性至关重要。然而，这些毒素复杂的化学结构给方法的可靠开发带来了巨大挑战。本研究开发了一种创新的分段多维液相色谱-串联质谱方法（sMD-LC-MS/MS），用于检测复杂根茎类草药中的85种霉菌毒素。通过整合多种心切技术、分段捕获以及双模式二维分离策略，该方法解决了传统一维分析中存在的共流出问题。结合简单的“稀释进样”流程，该系统无需离线纯化，从而提高了分析效率。在六种具有代表性的草药基质中的方法验证表明，这种“全景式”策略显著优于传统LC-MS/MS方法，在定性可靠性、定量精度以及检测灵敏度方面均有提升。它为在复杂草药基质中高效、可靠地检测微量多类霉菌毒素提供了系统解决方案。

**引言**
霉菌毒素主要是由曲霉、青霉、镰刀菌和链格孢等丝状真菌产生的有毒次级代谢产物[1]。它们在食品、饲料及其他植物源产品中的广泛存在对公共健康构成严重威胁，并带来巨大的经济损失[2]–[5]。迄今为止，已有超过400种结构各异的霉菌毒素被研究过[6]。其中，黄曲霉毒素、伏马毒素、赭曲霉毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮等高毒性霉菌毒素因频繁出现且具有肝毒性、肾毒性、致癌性、致畸性、免疫毒性、遗传毒性、神经毒性等多种毒性作用，而受到国际上的严格监管[7]–[8]。许多国家已为这些常见污染物在高风险植物源产品中的残留设定了最高限量[9]–[10]。然而，仍有大量霉菌毒素未被纳入现行监管框架，尤其是新发现的变异类型以及新兴霉菌毒素[11]–[12]。当这些化合物同时存在时，可能会产生协同或叠加的毒性效应，进一步增加健康风险[10]–[14]。与仅关注受监管的霉菌毒素相比，对多种霉菌毒素进行广谱监测有助于更全面地了解潜在安全风险，并为科学监管提供依据。

草药在种植、采收、加工和储存过程中极易受到霉菌毒素污染[15]–[17]。越来越多的证据表明，草药产品中常常存在多种霉菌毒素共存的情况，这引发了对其潜在健康风险的严重担忧[18]–[20]。因此，准确检测这些污染物对于草药的安全评估和质量控制至关重要。然而，这些毒素复杂的化学结构给方法的可靠开发带来了巨大挑战，尤其是对于那些来自植物根茎的草药[9]。这类基质中含有多种内源代谢物，如多糖、有机酸、色素、脂类、黄酮类、生物碱和皂苷等，它们的物理化学性质和浓度差异很大[21]。更为复杂的是，许多共提取的化合物与目标霉菌毒素具有相似的元素组成（如以CHON为基础的结构），这在仪器分析过程中会导致严重的光谱干扰[22]。这类相似性往往会影响检测的特异性和可靠性，使得在复杂的植物背景中准确识别和定量霉菌毒素变得极为困难。

目前，液相色谱-串联质谱法是常规检测多类霉菌毒素的主流方法[23]–[24]。其中，三重四极杆或混合线性离子阱质谱仪上的多重反应监测模式因其出色的灵敏度和选择性，被视为检测微量污染物的金标准[25]。然而，将该技术应用于复杂草药基质时仍面临诸多挑战。一方面，共提取的基质成分会导致严重的离子抑制效应（或较少见的离子增强效应），大幅降低目标霉菌毒素的信号强度，进而影响方法的灵敏度[26]–[27]；另一方面，基质衍生的干扰峰可能与目标分析物共流出，导致信号重叠，从而影响定性和定量的准确性[28]。

为解决这些问题，人们付出了大量努力来开发和优化样品前处理策略。例如，Wang等人[29]精心优化了一种基于QuEChERS的预处理方法，包括提取和纯化步骤，用于检测网纹柑橘皮中的15种受监管霉菌毒素。类似地，Jiang等人[30]开发了一种一步固相萃取方法，使用多壁碳纳米管并结合五种吸附剂（C18、亲水亲油平衡柱、混合模式阳离子交换柱、硅胶和氨基丙基柱），实现了对玉米和小麦中21种霉菌毒素的同时分析。这项工作展示了在谷物样品的分析中，在分析物覆盖范围和纯化效率之间取得平衡的可行性。然而，这种平衡往往具有基质特异性，当面对化学结构更为复杂的样品时则难以维持。在我们之前的研究[28]中，我们建立了一种基于QuEChERS的LC-MS/MS方法，用于广谱检测草药材料中的73种霉菌毒素。但当将该方法应用于化学结构更为复杂的根茎类基质时，由于其中次级代谢物含量丰富，该方法仍会受到基质干扰的影响，导致某些霉菌毒素无法被检测到或检测限升高。

除了样品前处理之外，强化色谱分离也是一种重要的补充策略[24]。传统的一维液相色谱虽然是一类多霉菌毒素分析的基础方法，但在应用于高度复杂的基质时往往存在显著局限性。其较低的分辨率和选择性容易导致结构相似的霉菌毒素共流出，且难以将它们与基质成分区分开来，从而增加了误检和定量不准确的风险[31]。此外，它依赖于单一流动相，无法同时优化所有分析物的电离效率，而强烈的基质效应则会进一步降低检测灵敏度和定量可靠性[26]–[32]。为应对这些局限，一些先进的液相色谱技术应运而生，如全面二维液相色谱[33]、在线心切LC-LC技术[34]–[35]以及集成式的“一体式”系统[36]–[37]。这些多维分析方法通过采用正交或互补的分离机制，有效提升了峰容量和分辨率，从而解决了各种分析难题[38]。例如，Campone等人采用了多次心切LC-LC-MS/MS方法，用于检测啤酒中的七种受监管霉菌毒素[39]。通过选择性地将含有目标分析物的组分从第一维转移到第二维，该方法实现了在线净化，大大降低了基质干扰，从而在复杂的食品基质中实现了准确的定量分析。然而，当用于多种霉菌毒素的广谱筛查时，溶剂兼容性问题会变得更加突出。Bogdanova等人采用了单次心切LC-LC技术，选择性地将在0.5至1.9分钟之间洗脱的高极性霉菌毒素组分转移到第二维进行分离[40]。结合四极杆飞行时间质谱仪，该系统能够在一次分析中检测茶叶样品中的70种霉菌毒素，不仅大幅扩展了霉菌毒素的检测范围，还降低了基质干扰。不过，这类循环型捕获LC-LC系统可能存在一些固有缺陷，如捕获能力有限、分析物可能泄漏，以及由于溶剂不匹配导致的峰形恶化。而集成式的“一体式”LC-MS系统则有效解决了这些问题。在分析全氟和多氟烷基物质时[37]，一种包含反相柱、弱阴离子交换捕获柱以及混合型HILIC/离子交换柱的阀切换系统，能够在线捕获那些在传统反相柱上几乎不会保留的超短链PFAS，同时在一轮分析中实现短链和长链PFAS的分离。这种设计不仅弥补了高极性PFAS检测范围的不足，还能通过大体积进样保持高灵敏度，从而在多种水基基质中实现全面的链长检测。同样，在针对新兴关注污染物进行多类筛查时[36]，一种定制的混合模式捕获柱与混合模式离子交换分析柱相结合，能够选择性地富集和分离那些在传统反相柱方法中会丢失的高极性离子型CECs。这两项研究都体现了“一体式”架构的灵活性，能够为具有不同物理化学性质的分析物提供定制化的分离路径。

在本研究中，我们提出了一种“全景式”策略，旨在解决复杂草药中多霉菌毒素分析中普遍存在的共流出和基质效应问题。我们通过整合多种心切技术、分段捕获以及双模式二维分离策略，开发了一种创新的分段多维液相色谱-串联质谱方法（sMD-LC-MS/MS）（见图1）。这种配置能够从第一维选择性地分离并捕获易受干扰的时段，然后在定制的第二维条件下进行依次重新分离，最终在一张色谱图中呈现完整的污染谱图。结合“稀释进样”的样品前处理方法，该技术显著提高了分析效率，同时降低了人力和材料成本。我们在六种具有代表性的根茎类草药基质中进行了严格的验证，结果表明该方法具有极高的准确度和灵敏度，显著优于传统的一维LC-MS/MS方法。总体而言，这种“全景式”的sMD-LC-MS/MS方法为复杂草药产品中霉菌毒素的全面监测提供了一种强大且高效的解决方案，其在食品和安全分析领域的应用前景十分广阔。

**章节节选**
**化学品与试剂**
本研究中使用的霉菌毒素分析标准品或单独的标准储备溶液购自Sigma-Aldrich（美国拉勒米）、Pribolab（中国青岛）、Tauto Biotech（中国上海）、Apollo Scientific（英国斯托克波特）、Romer Labs（奥地利图林）、Chiron AS（挪威特隆赫姆）以及BioAustralis（澳大利亚新南威尔士州）。这85种霉菌毒素标准品的详细信息见支持材料中的表S1。各标准储备溶液的制备方法如下：

**sMD-LC系统的构建**
当我们之前建立的常规一维LC-MS/MS方法被用于分析来自植物根茎的代表性草药中的多种霉菌毒素时，例如HQ和YZ，会在特定的保留时间窗口内出现严重的共流出现象和强烈的基质干扰（例如，F1组分在7.8–10.2分钟，F2组分在11.5–12.2分钟，F3组分在13.0–14.0分钟）。因此，这些时间窗口内洗脱出的霉菌毒素，包括那些受到严格监管的霉菌毒素，其检测结果都会受到影响。

**结论**
在复杂根茎类草药基质中检测微量多类霉菌毒素一直面临着严重的基质干扰问题。即使经过复杂的样品纯化处理，传统的单维LC-MS/MS方法也往往存在回收率不稳定的问题，难以在检测能力和检测范围之间取得平衡。在本研究中，我们提出了一种“全景式”的sMD-LC-MS/MS策略，以克服这些根本性的限制。通过整合多种心切技术、分段捕获以及……

**CRediT作者贡献声明**
曹一民：正式分析；冯睿：方法学、正式分析；沈吉：项目管理、资金获取、概念构思；陈苏云：实验研究、正式分析；胡青：资源保障、项目管理、概念构思；潘慧琴：写作——审稿与编辑、写作——初稿撰写、方法学验证、实验研究、资金获取、数据整理、概念构思；周恒：项目管理、资金获取、概念构思；秦晓雅：无

**利益冲突声明**
作者声明不存在利益冲突。

**致谢**
本研究得到了以下机构的资助：中国国家自然科学基金（项目编号：82104390）、上海市市场监督管理局科技支撑计划（项目编号：2024BZ20）、上海市自然科学基金（项目编号：23ZR1457200）以及上海市科学技术委员会（项目编号：21DZ2290200）。