牛至酚纳米乳（Carvacrol nanoemulsion）作为增强H9N2亚型禽流感疫苗效力的新方法

《Scientific Reports》：Carvacrol nanoemulsion as a novel approach to augment H9N2 influenza vaccine efficacy

　　

摘要：禽流感疫苗对预防季节性流感暴发和限制大流行至关重要，但其效力因抗原漂移和个体免疫应答差异而下降。研究人员假设牛至酚（Carvacrol），尤其是纳米乳（Nanoemulsion）形式的牛至酚，可增强禽H9N2疫苗效果并减轻病毒攻毒的影响。本研究通过评估肉鸡体内免疫应答及免疫组织病理学，考察了Carvacrol及Carvacrol nanoemulsion对禽流感疫苗效力的影响。研究结果表明，Carvacrol特别是其纳米剂型显著增强了免疫应答，表现为吞噬活性升高、血凝抑制（Hemagglutination inhibition, HI）效价提高及免疫器官指数改善。生化分析显示免疫调节细胞因子白细胞介素-10（Interleukin-10, IL-10）、IL-12及干扰素-γ（Interferon-γ, IFN-γ）水平显著升高，其他免疫相关参数亦升高；分子分析表明IFN-γ、IL-12、IL-10、Toll样受体4（Toll-like receptor 4, TLR4）、TLR3及TLR1相关基因上调。法氏囊（Bursa of Fabricius）、胸腺和脾脏中CD3表达明显增加，提示T细胞介导免疫增强及病原体识别能力改善。Carvacrol nanoemulsion增强流感疫苗免疫原性后对H9N2禽流感病毒提供更强保护，改善临床症状并在病毒攻毒后维持肺和气管结构完整性。结果强调了nanoemulsion技术在增强家禽免疫应答及提升禽流感疫苗效力方面的潜力，可支持更有效的流感病毒防控。因此，禽流感控制计划可将Carvacrol nanoemulsion作为免疫增强型佐剂纳入，nanoemulsion递送系统为在不改变免疫程序前提下增强现有疫苗提供了实用工具。

论文解读：牛至酚纳米乳（Carvacrol Nanoemulsion）增强H9N2禽流感疫苗效力的体内研究

研究背景与意义

禽流感病毒（Avian influenza virus, AIV），尤其是H9N2亚型，对家禽业造成严重经济损失并具人畜共患风险。现行禽流感疫苗常因抗原漂移及免疫原性不足导致保护力有限，且部分人群或禽类对传统疫苗应答较弱。天然植物化合物因具备抗菌、抗炎及免疫刺激特性被视为潜在的疫苗佐剂（Adjuvant，指与抗原共同接种以增强特异性免疫应答的物质）。牛至酚（Carvacrol，源自牛至Origanum vulgare及百里香Thymus vulgaris的单萜酚类成分）已被报道具免疫调节作用，而纳米乳（Nanoemulsion，热力学不稳定的胶体分散体系，可改善脂溶性物质稳定性与生物利用度）技术可提升其递送效率。该研究发表于《Scientific Reports》，旨在探究Carvacrol及其纳米乳作为H9N2灭活疫苗佐剂在肉鸡模型中对体液免疫、细胞免疫、免疫器官发育及攻毒保护的效果及分子机制，以验证其替代或补充传统铝佐剂的可行性。

主要关键技术方法

研究人员采用300只1日龄Ross 308肉鸡随机分为5组（n=60/组，3重复）：阴性对照（NC，不免疫不处理不攻毒）、阳性对照（PC，不免疫不处理攻毒）、疫苗单独组（V，皮下接种灭活H9N2疫苗）、疫苗+游离Carvacrol组（VC，饲粮添加1% Carvacrol）、疫苗+Carvacrol nanoemulsion组（VN，饲粮添加1% Carvacrol nanoemulsion）。所有组于3日龄点眼接种新城疫B1+传支活苗、10日龄接种传染性法氏囊病（IBD）活苗。28日龄经鼻内接种10⁸EID₅₀（50% egg infective dose，鸡胚半数感染量）H9N2低致病性毒株攻毒。分别于免疫后不同时间点采集血清、免疫器官（脾、胸腺、法氏囊）及攻毒后呼吸道组织，检测指标包括：血凝抑制（HI）抗体效价（log₂）、外周血单核细胞吞噬活性（Phagocytic activity, PA）与吞噬指数（Phagocytic index, PI）、免疫器官指数（Organ weight/Body weight kg）、血清溶菌酶（Lysozyme, LYZ）、一氧化氮（Nitric oxide, NO）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）、总抗氧化能力（Total antioxidant capacity, TAC）、丙二醛（Malondialdehyde, MDA）、ELISA定量细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10、IL-12、IFN-γ）、实时荧光定量PCR（RT-qPCR，采用2^-ΔΔCt法）检测脾脏IL-1、IL-6、TNF-α、IFN-γ、IL-12、IL-10、TLR1、TLR3、TLR4 mRNA相对表达量（以β-actin为内参）、免疫组化（Immunohistochemistry, IHC）检测胸腺/法氏囊/脾脏CD3⁺T淋巴细胞分布、H&E染色观察法氏囊/胸腺/肺/气管组织病理形态并进行图像分析。

研究结果

Hemagglutination inhibition antibody titers（血凝抑制抗体效价）

每周检测HI效价（log₂），母源抗体14日龄后消退。14、21、28日龄时VN组HI效价（log₂6.9±0.76）显著高于V组（log₂5.9±0.58）及VC组（log₂6.4±0.75）（p<0.01），且VN与VC均高于V组。攻毒后7天VN组HI升幅低于V组，提示疫苗联合Carvacrol nanoemulsion已建立有效免疫记忆减少强再激活。结论：Carvacrol及nanoemulsion均可提升H9N2疫苗诱导的特异性体液免疫，nanoemulsion效果更优。

Phagocytic activities（吞噬活性）

28日龄检测外周血单核细胞对白色念珠菌（Candida albicans）的吞噬功能。VN组吞噬百分比（38%）及吞噬指数（1.38）显著高于VC组（31%，1.27）、V组（28%，1.25）及NC组（25%，1.19）（p<0.0001）。结论：Carvacrol nanoemulsion显著增强先天免疫细胞（巨噬细胞/单核细胞）的吞噬与抗原摄取能力。

Immune organ indices（免疫器官指数）

VN组胸腺、脾脏、法氏囊指数分别为0.35、0.40、0.34 g/kg，高于VC组（0.28、0.36、0.30）及V组，NC组最低。VN组法氏囊/脾脏、胸腺/脾脏、法氏囊/胸腺比值亦最高。结论：Carvacrol nanoemulsion促进中枢免疫器官（法氏囊B细胞成熟场所、胸腺T细胞成熟场所）及外周免疫器官（脾脏）发育，反映整体免疫状态增强。

Oxidative stress and immunity related attributes（氧化应激与免疫相关指标）

14、21、28日龄VN组MDA（脂质过氧化产物标记物）及NO水平最低，TAC、SOD及溶菌酶水平最高（p<0.0001 vs NC/PC），优于VC及V组。结论：Carvacrol nanoemulsion减轻疫苗接种引发的氧化应激，提升内源性抗氧化防御及天然免疫分子（溶菌酶）活性。

Cytokines levels using ELISA assay（细胞因子ELISA检测）

疫苗后48 h各免疫组促炎因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）短暂升高后回落；VN组促炎因子峰值最低（p<0.0001），避免过度炎症。免疫调节因子IL-10、IL-12、IFN-γ在VN组全程表达最高（p<0.0001），峰值出现在48 h后渐降。结论：Carvacrol nanoemulsion抑制过度炎症反应同时上调Th1型（IFN-γ、IL-12）及调节性（IL-10）细胞因子，促进均衡的Th1/Treg偏向免疫。

Gene expression profiles（基因表达谱）

RT-qPCR显示VN组促炎基因IL-1、IL-6、TNF-α上调幅度最小（fold change分别约1.5、1.4、1.5），与ELISA一致。免疫相关基因IFN-γ（~4倍）、IL-12（~3.5倍）、IL-10（~3.2倍）、TLR4（~4倍）、TLR3（~3倍）、TLR1（~3.5倍）在VN组上调最显著，高于VC及V组（p<0.0001）。结论：Carvacrol nanoemulsion通过TLRs信号通路相关基因上调及Th1/调节性细胞因子基因表达增强，从转录水平强化抗原识别与适应性免疫启动。

Immunohistochemistry（免疫组化—CD3⁺T细胞）

IHC检测CD3（T细胞受体复合物的信号转导亚基，标记成熟T淋巴细胞）显示VN组胸腺皮质与髓质、法氏囊滤泡相关上皮（FAE）区及脾脏淋巴鞘（Peri-ellipsoidal lymphoid sheath, PELS）CD3⁺细胞数最多、染色最强（28日龄达高峰），VC组次之，V组再次之，NC最少。结论：Carvacrol nanoemulsion促进T淋巴细胞在各淋巴器官的增殖与滞留，证实细胞介导免疫（Cell-mediated immunity, CMI）被有效增强。

Immunohistopathological findings（免疫组织病理—法氏囊与胸腺H&E）

法氏囊与胸腺组织形态计量学显示VN组淋巴滤泡直径、皮质厚度、髓质厚度及皮质/髓质比最大，滤泡内淋巴细胞密度最高；VC组中等；V与NC较小。结论：Carvacrol nanoemulsion改善中枢免疫器官的组织学成熟度与淋巴细胞增殖活性。

Evaluation parameters in response to avian influenza H9N2 virus challenge（H9N2攻毒评估）

PC组出现严重呼吸道症状、剖检见气管肺充血、法氏囊炎、死亡率7%；V组症状减轻；VC组更轻（死亡率2%）；VN组仅轻微或不显临床症状、无死亡、剖检无明显病变。组织病理：攻毒后5及10天VN组气管上皮基本完整、肺组织结构接近正常，仅见轻度血管充血，明显优于V、VC及PC组。结论：Carvacrol nanoemulsion联合H9N2疫苗提供最佳临床保护与呼吸道组织学保护，有效抵御低致病性H9N2攻毒。

讨论与结论总结

讨论指出传统疫苗佐剂局限性及天然产物免疫调节优势，纳米包封可提高Carvacrol水溶性与肠道吸收进而增强与肠相关淋巴组织（Gut-associated lymphoid tissue, GALT）互作。本研究证实Carvacrol nanoemulsion通过抗氧化、下调过度炎症、上调TLRs及Th1/IL-10轴、促进免疫器官发育与T细胞活化，协同疫苗产生更高HI抗体、更强吞噬功能及更佳攻毒保护。局限性为未检测攻毒后排毒量（病毒载量）及攻毒后CD3动态。

结论（翻译）：本研究强调Carvacrol特别是其nanoemulsion形式作为禽H9N2疫苗佐剂在增强肉鸡免疫应答方面的重大潜力。Nanoemulsion制剂显著提升鸡只免疫应答，提供更强的H9N2 AIV保护，并在病毒攻毒后维持内脏结构完整性且避免过度炎症。该受控的炎症反应表明nanoemulsion技术不仅改善Carvacrol的生物利用度与效力，也为平衡增强疫苗效果提供思路。结果凸显Carvacrol nanoemulsion在优化疫苗性能与免疫防护中的作用，可作为家禽健康管理策略，并具拓展至更广疫苗与免疫治疗开发的潜力。需进一步研究以确立Carvacrol nanoemulsion作为人兽共用疫苗佐剂的适用性。