《BioTech》：Next-Generation Metabolic Engineering of Capsaicinoids Biosynthesis in Chilli Pepper: Bridging Genomic Insights to Biotechnological Applications
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辣椒（Capsicum species）因其经济价值和独特的感官特性而在全球范围内广泛种植。其含有丰富的功能性代谢物，尤其是属于辣椒素类化合物（capsaicinoids）家族的香草酰胺类化合物，已被开发用于医药、营养、农业和化妆品领域。由于辣椒素类化合物具有
辣椒（Capsicum species）因其经济价值和独特的感官特性而在全球范围内广泛种植。其含有丰富的功能性代谢物，尤其是属于辣椒素类化合物（capsaicinoids）家族的香草酰胺类化合物，已被开发用于医药、营养、农业和化妆品领域。由于辣椒素类化合物具有高经济价值和广泛的应用前景，其市场需求日益增长。因此，提高辣椒中生物活性代谢物特别是辣椒素类化合物的含量成为当务之急。基因组学（genomics）、转录组学（transcriptomics）、蛋白质组学（proteomics）和代谢组学（metabolomics）等多组学方法已大大促进了对辣椒素类化合物生物合成复杂调控网络的理解。苯丙烷途径（phenylpropanoid pathway）和支链脂肪酸途径（branched-chain fatty acid pathway）中的关键结构基因、转录因子（transcription factors, TFs）和信号通路已被鉴定，为辣椒的代谢工程提供了有价值的靶点。尽管取得了这些进展，但辣椒中定向增强辣椒素类化合物产量的遗传改造方法的整合仍然有限。近年来，以CRISPR/Cas-mediated 基因组编辑为代表的生物技术发展，使得对植物代谢途径和调控网络进行精确遗传修饰成为可能。因此，该技术有助于对辣椒素类化合物生物合成途径中的关键基因进行精确修饰，为提高辣椒中辣椒素类化合物含量提供潜在策略。然而，辣椒中的CRISPR/Cas-mediated 基因组编辑仍处于早期阶段，目前尚无通过该技术成功提高辣椒素类化合物含量的报道。迄今为止，尚未有综述系统评估CRISPR-Cas-mediated 基因组编辑在辣椒辣椒素类化合物代谢工程中的应用。本综述批判性评估了辣椒中CRISPR/Cas-mediated 代谢工程的最新进展，特别聚焦于辣椒素类化合物生物合成的调控基因。此外，多组学方法有望通过鉴定关键调控基因、优化基因组编辑靶点和预测代谢结果来补充这些策略，从而实现辣椒素类化合物产量的提升。总体而言，本综述为通过先进基因组编辑技术提高辣椒中辣椒素类化合物积累提供了见解。
2. 辣椒的经济价值与当前生产概况
辣椒作为全球性的多用途作物，具有显著的经济价值、烹饪用途和药用价值。辣椒果实富含维生素（A、E、C及B族复合物）、矿物质（磷、钾、钙、钠、铁等）以及功能性化合物如黄酮类和辣椒素类化合物。目前全球辣椒种植面积达450万公顷，年产量约5900万吨，印度以近39.78%的全球产量位居首位，中国以8.67%紧随其后。全球辣椒市场正快速扩张，预计从2025年的108.8亿美元增长至2032年的170.6亿美元，复合年增长率（CAGR）达6.63%。这一增长趋势凸显了改进育种和遗传改良策略以开发高产、高辣椒素类化合物含量辣椒品种的紧迫性。
3. 辣椒代谢物及其健康益处的概述
辣椒作为功能性食品日益受到关注，其富含的次生代谢物赋予多种治疗应用。辣椒素（capsaicin）和二氢辣椒素（dihydrocapsaicin）是主要辣椒素类化合物，占总量约90%，其中辣椒素单独占约71%。这些化合物主要通过激活瞬时受体电位香草酸亚型1（transient receptor potential vanilloid-1, TRPV1）通道发挥生物学效应，导致细胞内钙离子水平升高、儿茶酚胺释放刺激及交感神经系统激活，从而增强产热、能量消耗和脂肪氧化。此外，辣椒素还可调节AMP激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase, AMPK）通路和过氧化物酶体增殖物激活受体α（peroxisome-proliferator-activated receptor alpha, PPARα），调控脂肪氧化、改善胰岛素敏感性、减少体脂并增强肝脏和心脏功能。辣椒还富含特征性类胡萝卜素如辣椒红素（capsanthin）和辣椒玉红素（capsorubin），以及多酚类化合物如黄酮类（木犀草素、槲皮素）和酚酸类（阿魏酸、咖啡酸），这些化合物增强抗氧化防御并调节炎症和代谢信号通路。
4. 后基因组时代的下一代代谢工程
多组学方法显著推进了植物代谢工程领域。在辣椒中，基因组学有助于理解基因组结构和功能动力学，促进代谢途径关键基因的鉴定。目前已有多个栽培和野生辣椒品种的基因组被成功解析，为比较基因组研究和辣椒素类化合物生物合成相关基因的鉴定提供了平台。转录组学测序数据集为重建基因表达谱和解析基因调控机制提供了宝贵资源。通过整合RNA-seq数据与代谢谱分析，研究人员可鉴定与辣椒素类化合物积累相关的差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）。例如，研究者在C. frutescens L.的胎座和果皮组织中鉴定出54,045个DEGs，并报道了二羟酸脱水酶（dihydroxyacid dehydratase, DHAD）、 Prephenate转氨酶（prephenate aminotransferase, PAT）和苏氨酸脱氨酶（threonine deaminase, TD）三个参与辣椒素类化合物生物合成的结构基因。蛋白质组学有助于鉴定代谢途径中的蛋白质，从而提供对调控蛋白和转录因子的深入认识。近期研究通过多组学方法从C. chinense和C. annuum的果皮和胎座组织中分别鉴定出4,473和2,012个蛋白质，关键蛋白包括酰基转移酶3（acyltransferase 3, AT3）、β-酮脂酰-ACP合成酶（ketoacyl-ACP synthase, KAS）、4-香豆酰辅酶A连接酶（4-coumaroyl co-A ligase, 4CL）和3-酮脂酰辅酶A合酶3（3-ketoacyl-coA synthase 3, KCS3）等，为通过基因组编辑途径开发高辣椒素类化合物含量的改良辣椒品种提供了有价值的多组学资源。
5. 辣椒辣椒素类化合物的生物合成途径
辣椒素类化合物是在辣椒果实中合成的酚类生物碱分子，主要包括辣椒素和二氢辣椒素。其生物合成发生在花后16天至成熟绿果阶段的胎座组织中，通过支链脂肪酸途径和苯丙烷途径的协同作用进行调控。苯丙烷途径产生香草胺（vanillylamine），支链脂肪酸途径产生9至11个碳原子的前体脂肪酸，两者经酶促缩合反应形成辣椒素类化合物。该途径涉及多个关键酶：苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase, PAL）催化L-苯丙氨酸转化为反式肉桂酸；肉桂酸4-羟化酶（cinnamate 4-hydroxylases, C4H）将反式肉桂酸转化为4-香豆酸；4-香豆酸经4-香豆酰辅酶A连接酶（4CL）激活形成4-香豆酰辅酶A；随后经羟基肉桂酰辅酶A：莽草酸羟基肉桂酰转移酶（hydroxycinnamoyl-CoA:shikimate hydroxycinnamoyl transferase, HCT）、4-香豆酸3-羟化酶（4-coumarate 3-hydroxylase, C3H）等酶催化生成咖啡酰辅酶A，再经咖啡酰辅酶A O-甲基转移酶（Caffeoyl-CoA O-methyltransferase, CCOAOMT）转化为阿魏酰辅酶A；羟基肉桂酰辅酶A水合酶/裂解酶（hydroxycinnamoyl-CoA hydratase/lyase, HCHL）催化阿魏酰辅酶A生成香草醛，香草醛再经香草醛转氨酶（vanillin aminotransferase, VAMT）催化转氨生成香草胺。支链脂肪酸途径中，支链氨基酸转氨酶（branched-chain amino acid transaminase, BCAT）将缬氨酸转化为α-酮异戊酸；支链α-酮酸脱氢酶/脱羧酶（branched-chain alpha-ketoacid dehydrogenase/decarboxylase, BCKDH）复合物催化生成异丁酰辅酶A；随后经β-酮脂酰-ACP合成酶（KAS）和酰基载体蛋白（acyl carrier protein, ACP）等酶作用，通过酰基-ACP硫酯酶（acyl-ACP thioesterase, FatA）形成8-甲基-6-壬烯酸，再经酰基辅酶A合成酶（acyl-CoA synthetase, ACS）转化为8-甲基-6-壬烯酰辅酶A。最终，由苯丙烷途径产生的香草胺与支链脂肪酸途径产生的8-甲基-6-壬烯酰辅酶A在辣椒素合成酶（capsaicin synthase, CS）即AT3编码酶（Pun1基因产物）的催化下缩合形成辣椒素。尽管辣椒素类化合物生物合成途径已被较好描述，但调控苯丙烷途径通量、支链脂肪酸前体和Pun1表达的转录因子仍有待深入探索。
6. 辣椒素类化合物生物合成途径中的关键基因概述
遗传和环境因素显著影响辣椒中辣椒素类化合物的积累，其中等位基因变异是不同品种间辣度差异的主要决定因素。目前已鉴定多种参与辣椒素类化合物生物合成的基因，编码辣椒素合成酶（CS）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、支链氨基酸转氨酶（BCAT）、肉桂酸4-羟化酶（C4H）、酰基-ACP硫酯酶/转移酶（ACL）、氨基转移酶（AT3）、4-香豆酸-辅酶A连接酶（4CL）、β-酮脂酰-ACP合成酶（KAS）、酰基-ACP硫酯酶（FatA）、酰基辅酶A合成酶（ACS）等酶类。研究表明，pAMT、KAS和AT等基因是胎座组织特异性表达基因，参与辣椒素的合成。Pun1基因编码的AT3酶是辣椒素类化合物生物合成不可或缺的关键酶，负责催化最后阶段香草胺与脂肪酸的缩合反应。Pun1（AT3）基因被认为是辣度的关键决定因子，该位点的突变或缺失会导致非辣表型。沉默AT3会负面影响pAMT、BCAT、KAS和ACL等其他重要基因的表达，表明AT3（Pun1）还在这些生物合成基因的转录调控中发挥关键作用。
7. 辣椒中CRISPR/Cas介导的代谢工程的机遇与挑战
基因组编辑是精确修饰特定基因组位点的强有力遗传工程方法，包括巨型核酸酶、锌指核酸酶（zinc-finger nucleases, ZFNs）、转录激活因子样效应物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases, TALENs）和CRISPR/Cas等技术。CRISPR/Cas9系统因其设计简便、成本低、效率高、可重复性好和育种周期短等优势，成为代谢工程的强大工具。其可实现基因敲入或敲除以修饰植物的理想性状，且可在不含外源DNA的情况下进行靶向位点特异性修饰。CRISPR/Cas9变体如CRISPR激活（CRISPR activation, CRISPRa）和CRISPR干扰（CRISPR interference, CRISPRi）是可逆的转录调控工具：CRISPRa将核酸酶失活Cas9（nuclease-dead Cas9, dCas9）与转录激活因子结合以促进RNA聚合酶招募并上调基因表达；CRISPRi则通过dCas9系统抑制RNA聚合酶初始结合，下调靶基因表达。
CRISPR/Cas系统已成功用于改变多种植物的代谢途径，如颠茄（Atropa belladonna）、聚合草（Symphytum officinale）、番茄（Solanum lycopersicum）、盾叶薯蓣（Dioscorea zingiberensis）、菊苣（Cichorium intybus）、大豆（Glycine max）、罂粟（Papaver somniferum）、水稻（Oryza sativa）和蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）等。例如，在番茄中，通过多重CRISPR/Cas9介导的GABA-TP1、GABA-TP2、GABA-TP3、CAT9和SSADH等基因的突变，显著提高了编辑株系叶片和果实中的γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid, GABA）含量；在聚合草中，CRISPR/Cas9介导的HSS基因敲除降低了突变株系中吡咯里西啶生物碱水平。
然而，CRISPR/Cas9介导的基因组编辑在辣椒物种中的应用仍处于早期阶段。迄今为止，尚无利用CRISPR/Cas介导的基因组编辑增强辣椒中辣椒素类化合物生物合成的报道。Bulle等研究者开发了针对C. annuum中八氢番茄红素脱氢酶（phytoene desaturase, PDS）基因的CRISPR/Cas9基因递送系统，通过生物弹道法递送CRISPR/Cas9试剂，实现了高达62.5%的编辑效率。转录因子是基因转录调控的重要组分，某些转录因子的操控可导致代谢途径中特定靶基因表达的转录组变化，从而增强目标代谢物。目前多数研究采用病毒诱导基因沉默（virus-induced gene silencing, VIGS）技术改变辣椒素类化合物生物合成途径，如CcMYB24转录因子作为苯丙烷代谢途径的负调控因子，其沉默使C. chinense胎座中辣椒素生物合成基因COMT、C4H和AT3的表达水平提高，辣椒素含量增加超过31.72%；沉默CCR1基因使C. chinense果皮和胎座中的木质素水平分别降低10.2%和13.5%，辣椒素水平分别提高5%和9.6%；沉默CcCCR2使果皮和胎座木质素分别降低18.8%和22.8%，辣椒素分别提高16.2%和19.1%。
CRISPR/Cas技术应用的主要瓶颈包括低转化效率、基因型依赖性再生能力和组织培养顽拗性。Park等研究者比较了三种农杆菌菌株（AGL1、EHA101和GV3101）对辣椒品种（辣椒CM334和甜椒Dempsey）的编辑效率，发现EHA101菌株在两个品种中均表现出最高的CaMLO2基因编辑效率，而GV3101菌株在甜椒Dempsey中表现出更好的愈伤组织诱导活性。脱靶修饰是CRISPR-Cas技术的主要挑战，严格的计算机模拟向导RNA（guide RNA, gRNA）设计和验证对确保编辑株系的完整性和生物安全性至关重要。基于人工智能的深度学习工具为CRISPR/Cas基因组编辑策略提供了优异的的数据处理和分析能力，可检测脱靶基因、优化编辑过程、设计gRNA和预测基因组编辑结果。此外，人工智能工具的整合还有助于开发和改进碱基编辑（base editing）、先导编辑（prime editing）和表观基因组编辑（epigenome editing）等精密基因组编辑方法。
目前，辣椒中CRISPR/Cas介导基因组编辑的主要障碍包括试剂递送困难和植物再生协议高度依赖基因型和品种。Agrobacterium介导转化、原生质体转染和核糖核蛋白（ribonucleoprotein, RNP）直接递送等编辑技术有助于简便地生成无转基因编辑植物。未来应重点发展高效的CRISPR/Cas介导基因组编辑协议，为食品、农业和制药工业提供充足的辣椒素类化合物原料。
8. 结论与未来展望
植物能够产生多样化的次生代谢物，对人类具有营养和医药价值。辣椒是生物活性分子的优良来源，尤其是辣椒素类化合物。目前辣椒素类化合物的生产主要依赖于从辣椒中提取，但受限于低代谢产量和环境变异性。在后基因组时代，多组学方法有助于理解基因组组织和负责代谢途径的关键基因。CRISPR/Cas系统为辣椒素类化合物生物合成的靶向代谢工程提供了有前景的平台，人工智能辅助分析工具的整合进一步改善了对辣椒素类化合物积累调控网络的理解。
然而，CRISPR/Cas介导的代谢工程在辣椒中的实际应用仍面临重大挑战：低转化效率、基因型依赖性再生能力、组织培养顽拗性、缺乏稳健且普遍适用的基因递送系统；潜在的脱靶修饰和非预期代谢后果需要彻底评估以确保遗传稳定性和生物安全性；基因组编辑作物的监管状态在不同国家间存在显著差异；大多数研究在受控实验室或温室条件下进行，缺乏田间环境下的全面验证。因此，未来研究应优先发展高效的转化和再生协议、改进的基因组编辑试剂递送系统、严格的脱靶评估框架以及编辑种质的大规模田间验证。尽管人工智能、多组学方法和CRISPR/Cas技术的整合代表了辣椒素类化合物代谢工程的有前景方向，但在这些技术可常规应用于实际辣椒育种计划之前，必须解决重大的技术、生物学和监管挑战。
