地下水经IDEXX Legiolert法分析后嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)确证方法的评价

《Microbiology Spectrum》：Evaluation of Legionella pneumophila confirmation methods following IDEXX Legiolert analysis of groundwater

　　

摘要：IDEXX Legiolert检测已被用于定量各类饮用水及非饮用水中嗜肺军团菌(Legionella pneumophila, L. pneumophila)。例如，内华达州南部水务局(Southern Nevada Water Authority, SNWA)在与州监管机构协调下，已实施处理策略及相应的L. pneumophila监测（采用Legiolert法）以确保地下水水质及公共卫生。由于Legiolert对L. pneumophila具有特异性，Legiolert阳性结果通常被认为无需确证，但既往文献报道地下水系统Legiolert检测存在较高假阳性率。本研究对Legiolert阳性孔中收获的液体培养基评估了四种确证方法：乳胶凝集试验(latex agglutination)、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-MS)、靶向mip和srkA基因的快速荧光定量聚合酶链反应(qPCR)，以及 buffered charcoal yeast extract(BCYE)琼脂平板（±L-半胱氨酸）。除BCYE外，其余确证方法可在＜24 h内出具结果，便于监管部门及水务部门快速决策。以qPCR检测mip基因为基准，mip基因qPCR的确证率最高（96%），依次为MALDI-MS（92%）、乳胶凝集（88%）及BCYE（±L-半胱氨酸）（88%）。尽管单独使用Legiolert法可有效且较准确地检测L. pneumophila，但确证试验可提供有价值的信息，包括血清群判定及假阳性鉴别（如嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonas maltophilia）。综上，本研究数据阐明了各种L. pneumophila确证方法的优缺点，可为SNWA及其他饮用水公用事业机构的报告编制与决策制定提供参考。

论文解读：地下水经IDEXX Legiolert法分析后嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)确证方法的评价

一、研究背景与目的

嗜肺军团菌(Legionella pneumophila, L. pneumophila)是引起军团病(Legionnaires' disease, LD)的胞内机会性致病菌，在美国及欧洲是饮水相关疾病、住院及死亡的首要原因。其广泛存在于自然及人工水环境（如建筑末梢管道系统、冷却塔）中，主要通过气溶胶传播。美国环保署(EPA)目前未对Legionella设强制监测要求，仅间接通过地表水处理规则(SWTR)和地下水规则(GWR)管理。地下水历史上不被视为L. pneumophila的重要贮存地，但近期研究表明公共地下水系统及私人井供水的室内管道中存在L. pneumophila，且用IDEXX Legiolert法监测地下水时文献报道存在较高假阳性率。内华达州南部水务局(SNWA)对地下水井实施L. pneumophila监测（MPN法，Legiolert），并与内华达州环境保护司(NDEP)制定行动水平（＜100 MPN/100 mL，处理目标＜5 MPN/100 mL）。由于Legiolert理论上特异于L. pneumophila故常省略确证步骤，但地下水基质可能导致非靶标微生物引起假阳性，影响运行决策（如关停水井）。为此，研究人员以Legiolert阳性地下水样品为对象，评价四种确证方法（乳胶凝集、MALDI-MS、mip/srkA基因快速qPCR、BCYE±L-半胱氨酸平板）的性能，为饮用水公用事业提供方法学依据。本研究发表于《Microbiology Spectrum》。

二、主要关键技术方法

研究人员于2025年4—7月内华达州拉斯维加斯谷地从直接入配水管网井(DDSW)及入氯消毒清水池井(RW，多为加氯前取样)采集地下水，经硫代硫酸钠脱氯后24 h内按制造商说明进行IDEXX Legiolert MPN培养（39°C，7 d）。从Legiolert阳性孔吸取液体分别进行四种确证：(1)乳胶凝集——直接用Legiolert液或BCYE(+L-半胱氨酸)单菌落与血清群1(SG1)、SG2?14及非嗜肺军团菌种乳胶微珠反应；(2)MALDI?MS——取Legiolert阳性液离心洗涤、甲酸/乙腈提取点靶或用BCYE单菌落直接涂布，Bruker Biotyper sirius分析（log score＞2.00为确认）；(3)快速qPCR——Legiolert液热裂解法提取DNA，CFX384系统扩增mip基因（L. pneumophila特异性）及srkA基因（SG1特异性）；(4)BCYE(±L?半胱氨酸)划线培养——观察+L-半胱氨酸生长且?L-半胱氨酸不生长判定为疑似阳性。以mip基因qPCR阳性为金标准比较各方法确证率，统计采用R(v4.5.0)单因素方差分析及Tukey检验(α=0.05)。

三、研究结果

Overview of samples（样品概况）

研究期间从＞600份地下水中随机选取105份Legiolert推定阳性样品（共108次检测，含同一样品多稀释度），其中40%为DDSW、60%为RW。L. pneumophila浓度为1–689 MPN/100 mL（中位数4.0 MPN/100 mL）。43份超NDEP处理目标(＞5 MPN/100 mL)，12份超行动水平(＞100 MPN/100 mL)，后者触发DDSW井关停或再采样措施。

Confirmation results（确证结果）

直接确证显示：mip基因qPCR确认104/108(96%)，MALDI?MS确认99/108(92%)，乳胶凝集确认95/108(88%)，BCYE(±L?半胱氨酸)确认95/108(88%)。BCYE间接乳胶凝集确认91/108(84%)，间接MALDI?MS确认101/108(94%)。三种快速法(＜24 h)确证率均不低于传统培养确证。

Confirmation by direct latex agglutination (<24 h)（直接乳胶凝集确证）

95例(88%)可确证并判读血清群（43例SG1，52例SG2?14）。13例无凝集中12例经qPCR/MALDI?MS证实为假阴性（实为L. pneumophila），3例SG1判定与qPCR不符。大体积水样(10 mL、100 mL)出现干扰致各法无法确证，1 mL体积各法均确认。乳胶凝集准确确证并正确分型86%(93/108)。

Confirmation by direct MALDI?MS (<24 h)（直接MALDI?MS确证）

99例(92%)确认为L. pneumophila，无血清群信息。两例因体积不足未测。三例未确认中：两例"No ID"（其一经他法确为SG2?14，其一为假阳性），一例误鉴定为嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)——对应Legiolert假阳性(106 MPN/100 mL)引致水井关停。间接MALDI?MS自一多稀释度样品中鉴定出共存菌Nocardia cyriacigeorgica。

Confirmation by rapid qPCR (<24 h)（快速qPCR确证）

mip基因qPCR确认104/108(96%)，其中两例未确认关联同一大体积样品干扰。srkA基因qPCR判定40/108(37%)含SG1。乳胶凝集判定SG1为43/108，二者差异源于交叉反应(L. pneumophila SG9与SG1 beads)或srkA不扩增。

Confirmation by direct BCYE (±L?cysteine) and indirect latex agglutination or MALDI?MS (≥48 h)（BCYE直接确证及间接确证）

95例(88%)符合典型L. pneumophila生长特征（+L?cys生长，?L?cys不生长）。13例未全符合中，12例?L?cys有生长（其中8例mip?qPCR阳性、7例MALDI?MS阳性——即BCYE假阴性但实际为L. pneumophila），1例真菌过度生长。值得注意的是6株经qPCR/mip及MALDI?MS确为L. pneumophila SG2?14却可在?L?cys弱生长且乳胶不凝集，提示可能存在L. pneumophila不典型菌株。BCYE准确识别率约90%，低于直接qPCR及MALDI?MS，且耗时2–7 d。

Influence of groundwater quality（地下水水质影响）

ANOVA显示余氯、浊度、L. pneumophila浓度对各确证方法阳/阴分组均值无显著影响(P＞0.05)，除BCYE：BCYE未确证组浊度(P＜0.05)及L. pneumophila浓度(P＜0.05)显著高于确证组，提示高浊/高浓度可能影响BCYE分离效果。

四、讨论与结论总结

讨论指出虽Legiolert具L. pneumophila选择性，地下水仍存在假阳性（本研究中约2%，3/108无法任何方法确证，其一被MALDI?MS鉴定为S. maltophilia致误判超标而关井）。以mip?qPCR确证率最高(96%)，并可加做srkA区分SG1；MALDI?MS次之(92%)，能识别干扰菌（S. maltophilia、N. cyriacigeorgica）；乳胶凝集与BCYE确证率最低(88%)，前者受主观判断及部分SG2?14非反应株限制，后者受某些L. pneumophila株可在无L?半胱氨酸BCYE弱生长影响且耗时长，不建议单独作确证。BCYE分离后再行MALDI?MS或乳胶凝集未见明显增益。研究局限含仅取单个Legiolert阳性孔确证、未评估Legiolert假阴性及灵敏度特异性、仅限地下水基质。

结论（翻译）

在本研究评价的所有确证方法中，mip基因qPCR对Legiolert阳性孔中L. pneumophila的确证率最高；通过增加srkA检测还可提供血清群信息（SG1与非SG1）。MALDI?MS确证率次之，且可鉴定交叉反应菌种，随数据库扩展其价值将提升。乳胶凝集与BCYE(±L?半胱氨酸)确证率最低，且曾出现Legiolert浓度＞100 MPN/100 mL时乳胶凝集错误确证SG1而致水厂采取运行措施之案例。先经BCYE(+L?半胱氨酸)分离菌落再行乳胶凝集或MALDI?MS未带来实质性确证优势。总体而言，内华达州南部地下水样品中Legiolert法对L. pneumophila假阳性率低（约2%）；尽管该法理论具L. pneumophila特异性且本研究佐证其有效性，确证试验仍具价值，至少对超出行动水平的样品应开展确证以支持后续决策。