精神分裂症iPSC衍生神经元培养物中的转录组特征与神经细胞组成

《Cells & Development》：Transcriptomic signatures and neural cell composition in schizophrenia iPSC-derived neuron cultures

　　

Bárbara S. Casas|Jorge Zú?iga|Sebastián Arizábalos|Michel Maluenda|Claudio Letelier-Naritelli|Verónica Palma|Martín Montecino

智利安德烈斯·贝洛大学医学院生物医学科学研究所

摘要

精神分裂症是一种与神经元功能及连接性异常相关的神经发育障碍。人们已利用源自诱导多能干细胞的神经元来构建该疾病的模型，研究发现患者与健康对照组之间存在显著差异。值得注意的是，这些培养物中星形胶质细胞的自发生成可能会影响功能和分子分析结果。本研究旨在探讨精神分裂症患者与健康对照组的诱导多能干细胞衍生神经元培养物在细胞组成上是否存在显著差异，并分析这些差异对转录组分析结果的影响。研究将三组健康对照组和四组精神分裂症患者的诱导多能干细胞分化为神经元培养物，随后通过免疫染色、RNA测序、转录组反卷积及流式细胞术对其特性进行分析。转录组分析发现，精神分裂症患者的神经元培养物存在基因表达差异，且与神经发育及突触功能相关的基因本体论通路出现富集现象。此外，SynGO分析显示与突触前及突触后结构相关的基因表达也发生改变。细胞类型反卷积分析表明，精神分裂症患者的神经元培养物中未成熟及有丝分裂后的神经元比例较高，而健康对照组则星形胶质细胞比例更高。流式细胞术进一步证实了这一点，即精神分裂症患者衍生的神经元培养物中NeuN阳性细胞核的比例更高。综上，我们的研究结果表明，精神分裂症患者神经元与胶质细胞之间的平衡失调可能有助于引发该疾病的相关表型。

引言

精神分裂症是一种严重的神经精神疾病，全球约有1–2%的人口受到影响。该病的典型症状通常在青春期晚期到成年早期出现，首次发病年龄多在20–25岁左右。精神分裂症是导致健康寿命损失最多的第三大精神疾病，其中30–54岁人群的年龄标准化DALY值最高。这说明精神分裂症会对中年人的生活质量造成严重影响，进而带来巨大的社会和经济负担（DSM-5诊断标准，2013；He等人，2020）。从生理层面来看，精神分裂症的发展伴随着大脑皮层灰质逐渐减少（Vita等人，2012），以及大脑连接性的下降，尤其是负责认知功能和执行控制的额叶皮层（Millan等人，2016）。

精神分裂症被普遍认为是由多种因素共同导致的疾病。目前的观点认为，其背后存在遗传多样性，这些遗传因素会在大脑发育过程中与环境因素相互作用，影响某些通路和过程，当这些因素与发育事件或其他环境风险结合时，就会引发疾病的发生（Birnbaum和Weinberger，2017；Costain和Bassett，2012；Insel，2010；Selemon和Zecevic，2015）。由于该病具有神经发育起源，近十年来人们一直在努力利用诱导多能干细胞来模拟精神分裂症的发病机制，因为这类细胞可作为研究人类胚胎早期发育过程中细胞生理学和连接性的重要模型。

来自精神分裂症患者的诱导多能干细胞已被分化为多种细胞类型，其中大多数为神经元相关细胞，包括神经干细胞、神经前体细胞、神经元、星形胶质细胞，以及最近的脑类器官，这些类器官能够在体外再现人类大脑发育的关键过程（Notaras等人，2022；Stachowiak等人，2017；Balan等人，2019）。先前的研究一致表明，精神分裂症患者衍生的细胞在形态、功能及分子层面都存在显著异常。与健康对照组衍生的细胞相比，精神分裂症患者衍生的神经前体细胞和神经元存在突触异常、神经元连接性下降、迁移能力减弱、氧化应激增加以及线粒体功能障碍等问题（Balan等人，2019；Das等人，2020；Hoffman等人，2019）。在分子层面，精神分裂症患者衍生的神经元存在广泛的转录调控异常，这些异常会影响与神经发育关键过程相关的信号通路，包括神经元分化、增殖、迁移、突触形成以及氧化应激反应等（Brennand等人，2011；Casas等人，2018；Da Silveira Paulsen等人，2012；Brennand等人，2015；Puvogel等人，2022）。

为了避免使用外源表达因子，一种常用的将诱导多能干细胞分化为神经元的方法是采用两步法：首先通过双重SMAD信号通路抑制将诱导多能干细胞分化为神经干细胞，然后再将其分化为神经元（Shi等人，2012）。有趣的是，这种方法以及后来其他研究团队所做的改进中，都会出现星形胶质细胞与神经元一同生长的现象。随着培养时间的延长，星形胶质细胞的数量也会增加，而这种增加被认为会促进神经元网络的成熟并提升神经元活性（Puvogel等人，2022；Shi等人，2012；Dannert等人，2023；Joung等人，2023；Cordella等人，2022）。尽管这一现象具有重要意义，但目前尚无系统性的研究来比较健康对照组与精神分裂症患者衍生的神经元培养物在细胞类型组成上的差异。此外，基于诱导多能干细胞衍生的神经元培养物进行的批量RNA测序分析可能会受到细胞类型组成差异的干扰，因为细胞比例的不同可能会独立于内在的转录变化影响基因表达谱。因此，准确了解这些诱导多能干细胞衍生神经元中的细胞类型组成对于正确解读与疾病相关的分子特征至关重要。

在本研究中，我们将三组健康对照组和四组精神分裂症患者的诱导多能干细胞分化为神经元培养物，并通过免疫染色和转录组分析对其特性进行检测。此外，我们还利用转录组反卷积和流式细胞术分析了每种神经元培养物中的细胞组成。

章节节选

诱导多能干细胞向神经元的分化

本研究中使用的七种诱导多能干细胞系均是通过重编程皮肤成纤维细胞获得的（Brennand等人，2011；Brennand等人，2015；Sochacki等人，2016；Takahashi等人，2007）。有关这些样本的识别信息、诊断情况，以及关于细胞重编程方法、多能性验证和基因组稳定性检测的参考资料均汇总在表1中。

诱导多能干细胞通过多能干细胞神经诱导培养基被分化为神经干细胞（A1647801，Thermo Fisher）

神经元培养物

来自精神分裂症患者和健康对照组诱导多能干细胞的神经干细胞被进一步分化为长期存活的神经元。这些神经元会从三维神经元聚集体中形成复杂的神经元网络结构（图1A）。已有研究表明，发展到这一阶段的神经元会表达典型的神经元标记物、突触蛋白，并表现出特征性的电活动（Puvogel等人，2022；Shi等人，2012）。与这些研究结果一致，我们对神经元培养物进行的免疫荧光染色也显示出了阳性反应

讨论

在本研究中，我们通过转录组分析、细胞类型反卷积以及流式细胞术，对精神分裂症患者和健康对照组诱导多能干细胞衍生的神经元培养物进行了特征分析。我们的转录组分析结果与先前的研究一致，显示出与神经发育及突触功能相关的通路存在异常（Balan等人，2019；Das等人，2020；Hoffman等人，2019；Brennand等人，2011；Casas等人，2018；Brennand等人，2015；Puvogel等人，2022），这进一步证明了我们的研究结果的可靠性

CRediT作者贡献说明

Bárbara S. Casas：论文撰写——初稿撰写、结果验证、研究指导、资源提供、项目管理、方法设计、实验开展、资金获取、数据整理、概念构思。Jorge Zú?iga：方法设计、数据整理。Sebastián Arizábalos：数据整理。Michel Maluenda：软件应用、数据整理。Claudio Letelier-Naritelli：数据整理。Verónica Palma：论文撰写——审阅与编辑、资源提供、概念构思。Martín Montecino：论文撰写——审阅与编辑

利益冲突声明

作者声明不存在任何利益冲突。

致谢

我们感谢Stevens K. Rehen博士提供的细胞样本，以及Víctor Pola博士在技术方面给予的帮助。支持本研究的资金来源包括：神经表观遗传学与可塑性千年研究计划（编号NCN2023_032，资金来源MM）、ANID-FONDECYT》常规项目编号1251450，资金来源MM）、ANID-FONDECYT》常规项目编号1221522，资金来源VP），以及ANID-FONDECYT》博士后项目编号3230411，资金来源BSC。