用于解析皮质样和多巴胺能样诱导神经元中蛋白质组图谱的人溶酶体贮积病(Lysosomal Storage Disorders, LSDs)研究工具包

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：A human lysosomal storage disorder toolkit for decoding proteome landscapes in cortical-like and dopaminergic-like induced neurons

　　

溶酶体通过降解经内吞和自噬途径递送的蛋白质以及回收细胞器生物合成所需的基本组分来维持细胞稳态。溶酶体贮积病（Lysosomal Storage Disorders, LSDs）是一类影响多种溶酶体功能的疾病总称。为便于对不同LSD基因类别进行分子表型分析，研究人员正在构建缺失单个LSD基因的人类胚胎干细胞（human Embryonic Stem Cells, hESCs）文库作为领域共享资源。本文报道了初始版本的LSD研究工具包——包含缺失23个LSD基因（主要为鞘脂贮积症/sphingolipidoses及神经元蜡样脂褐质沉积症/neuronal ceroid lipofuscinoses, NCL相关基因）的hESC系——及其用于生成皮质样诱导神经元（induced cortical-like neurons, iN）和中脑多巴胺能样诱导神经元（midbrain dopaminergic-like induced neurons, iDA）的蛋白质组学资源。通过对细胞器和亚细胞器组分的深度丰度及相关性分析，揭示了不同基因型和神经元类型中独特的蛋白质组改变模式所对应的潜在细胞固有细胞器脆弱性（organelle vulnerabilities）。研究人员表征了GBA1与ASAH1缺陷伴随的线粒体蛋白质组改变，并发现ASAH1?/?诱导神经元中存在突触和线粒体缺陷，且与神经元放电频率降低相关。此外，研究人员开发了用于全蛋白质组识别因LSD基因缺失而可能受扰动的单个蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-Protein Interaction, PPI）及蛋白质复合物的信息学流程。最后，研究人员利用冷冻电子断层扫描（cryo-Electron Tomography, cryo-ET）原位可视化了ASAH1缺陷内溶酶体的结构改变，显示其呈肿胀状，基本缺乏野生型细胞典型的致密内部膜结构，但含大量腔内小泡（intralumenal vesicle, ILV）区室。该工具包及配套蛋白质组图谱为界定LSD基因功能障碍及细胞器脆弱性相关的分子特征提供了研究资源。

本文解读发表于《Proceedings of the National Academy of Sciences》(PNAS)。

研究背景

溶酶体贮积病（Lysosomal Storage Disorders, LSDs）约有70余种临床亚型，定位于50余个基因，主要表现为溶酶体内脂质和糖蛋白分解缺陷，临床可表现为神经退行性疾病及智力障碍。虽然原发贮积缺陷已被较好描述，但LSD致病突变如何影响细胞功能障碍（包括细胞器水平改变）尚不完全清楚。已有研究表明不同LSD风险等位基因可能在细胞类型依赖性模式下产生特异的分子脆弱性，映射于各细胞器及通路，但缺乏系统性图谱。为此，研究人员开发了涵盖多数鞘脂贮积症及神经元蜡样脂褐质沉积症（Neuronal Ceroid Lipofuscinoses, NCL）相关LSD基因的人胚胎干细胞敲除工具包，并在诱导皮质样神经元（induced cortical-like neurons, iN）和中脑多巴胺能样诱导神经元（midbrain dopaminergic-like induced neurons, iDA）中进行深度蛋白质组学分析，绘制细胞器脆弱性图谱及蛋白质相互作用扰动谱。

主要关键技术方法

研究人员以携带诱导性AAVS1-NGN2 cassette及内源标记TMEM192-3xHA（用于LysoIP）的H9人胚胎干细胞（human Embryonic Stem Cells, hESCs）为对照，通过CRISPR-Cas9 RNP介导产生23种LSD基因纯合移码敲除hESC克隆。将对照及敲除细胞分化为第30天和第50天的iN与iDA神经元（生物学三联重复），采用nDIA-hrMS²（narrow-window Data-Independent Acquisition–High-Resolution MS²）质谱检测全蛋白质组（约10,000个蛋白）。整合基于亚细胞定位注释的细胞器丰度变化、成对蛋白质组相关性分析及器官相关性图谱构建；开发整合CORUM/ComplexPortal/PDB/BioGrid/STRING及AlphaFold-Multimer预测的一级（Tier 1）蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-Protein Interaction, PPI）数据库，评估蛋白质复合物节点丢失/扰动。辅以免疫荧光验证神经元标志物（TH/Tyrosine Hydroxylase、MAP2、SYP/Synaptophysin、Bassoon）、薄切片透射电镜观察突触超微结构、Fluo-4钙成像检测神经元放电活性、LysoIP（磁珠免疫沉淀带HA标记的TMEM192阳性晚期内体/溶酶体）结合脂质组学分析ASAH1^?/?HeLa细胞溶酶体脂质累积，及cryo-FIB milling偶联cryo-ET（cryoelectron tomography）观察ASAH1缺陷内溶酶体三维超微结构。

研究结果

A Stem Cell Toolkit for Systematic Analysis of LSD Genes.

研究人员在H9 hESC（含AAVS1-NGN2及TMEM192-3xHA heterozygous knock-in）背景下，利用CRISPR-Cas9 RNP敲除23个LSD基因（涵盖鞘脂贮积症：GBA1、ASAH1、HEXA、HEXB、PSAP、SMPD1；NCL：CLN1、CLN2、CLN3、DNAJC5、CLN5、CLN6、CLN7、CLN8、ATP13A2、GRN、CTSD、CTSF；黏脂贮积症IV型：MCOLN1/TRPML1；Niemann-Pick C型：NPC1、NPC2；Wolman病：LIPA；Pompe病：GAA），获得纯合移码indel克隆。蛋白质组验证显示靶LSD蛋白缺失（部分低丰度蛋白如CLN3未在全细胞裂解液中检出），且各敲除株可分化为iN和iDA并正常表达TH，证明工具包可用于后续分析。

Proteomic Fingerprint Resource for LSD Mutant iN and iDA Neurons.

对23种LSD KO及对照的Day 50 iN/iDA（n=3）及部分鞘脂相关KO的Day 30样本进行nDIA质谱，检出~10,000蛋白，仪器CV<10%。对照iN与iDA比较显示突触囊泡（SynapseSV）、线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）蛋白分别在iN和iDA中特异性富集，TH在iDA中约6倍富集，证实分化质量可靠。各LSD KO与对照比较显示显著改变蛋白数因基因型与细胞类型而异，预期LSD靶蛋白缺失，神经元分化标志物正常诱导，数据集稳健可进一步挖掘。

LSD Mutant iNeuron Organelle Landscapes.

按亚细胞注释计算各KO相对于对照的蛋白log₂FC均值，鞘脂贮积症和NCL部分KO在溶酶体/内体注释改变最大。三元图显示内体-溶酶体-OXPHOS改变聚类差异。器官相关性热图揭示不同KO重塑细胞器间相关性，如CLN5^?/?与GRN^?/?iDA在突触注释相似；SMPD1^?/?与ASAH1^?/?iN聚为一类。最高基因型间变异见于线粒体、内溶酶体和突触囊泡蛋白组，iDA中SynapseSV变异大，iN中鞘脂类变异大。表明LSD基因型与神经元类型互作决定细胞器蛋白质组景观。

Sphingolipidoses-Related Mitochondrial Proteome Signatures.

鉴于GBA1突变关联线粒体功能障碍及图2A中线粒体在鞘脂KO iDA中受影响明显，研究人员聚焦分析。线粒体蛋白相关性图显示鞘脂KO iDA（特别是GBA1^?/?、ASAH1^?/?）呈负相关，HEXA^?/?/HEXB^?/?/PSAP^?/?呈正相关，暗示不同行为。GBA1^?/?与ASAH1^?/?iDA在线粒体尤其是OXPHOS（氧化磷酸化复合体）和线粒体基质（mitochondrial matrix, mtMatrix）蛋白丰度下调上有重叠，iN中无重叠。ASAH1^?/?iDA的OXPHOS蛋白与其他LSD KO呈负相关性连接显著。说明特定鞘脂代谢基因缺失以神经元亚型依赖方式选择性降低线粒体中OXPHOS等蛋白丰度。

Sphingolipidoses-Related Synaptic Proteome Signatures.

鞘脂KO普遍溶酶体蛋白上调伴突触蛋白下调。ASAH1^?/?iDA中SynapseSV和SV fusion（突触囊泡融合）注释呈小幅负相关，iN中为正相关。GBA1^?/?与ASAH1^?/?iDA选择性降低SV fusion蛋白丰度。SV fusion类别与特定LSD KO呈多个负相关链接。提示ASAH1与GBA1缺陷多巴胺能神经元存在突触脆弱性。

An Approach for Decoding Protein Complex-Level Vulnerabilities.

构建含CORUM/ComplexPortal/PDB验证互作、BioGrid/STRING高通量数据及AlphaFold-Multimer预测Tier 1 PPI网络（~7,100对PPI，55.9%有PDB结构），扩展得到408个蛋白复合物（含138个未见报道的新候选复合物）。统计各KO中因亚基丰度显著下降导致PPI edge"减少"（disrupted）或所有edge"丢失"（lost）的节点。CLN3/CLN5/CLN6/MCOLN1^?/?扰动比例高。实例如下：GBA1^?/?iN/iDA中线粒体复合体I（Complex I, NADH:ubiquinone oxidoreductase）分别有7/10个节点丢失或扰动；MCOLN1^?/?iN中BLOC-1（Biogenesis of Lysosome-related Organelles Complex-1）复合体4–5节点丢失/扰动；NPC1^?/?iN中Commander复合体9节点扰动；GBA1^?/?和MCOLN1^?/?中谷氨酸受体组装扰动；ASAH1^?/?中GATOR复合体、细胞色素c氧化酶复合体及CCZ1-MON1-RMC1（RAB7 GEF on lysosomes）复合物扰动。证明PPI流程可系统性映射超出细胞器水平的复合物脆弱性。

Synaptic Function in ASAH1^?/?iDA Cells.

电镜显示ASAH1^?/?iDA/iN突触结构紊乱，突触小泡数目少且大小不均。免疫荧光见ASAH1^?/?iDA中SYP（Synaptophysin）与Bassoon共定位对象显著少于对照，且SYP puncta总数下降，部分SYP不与Bassoon共标，提示突触前区室组织缺陷。Ca²⁺成像显示Day 50 ASAH1^?/?iDA自发及KCl刺激后活性ROI比例及平均发放率显著低于对照（可部分被KCl挽救），iN中影响轻微。表明ASAH1缺陷致iDA突触蛋白组改变与功能性放电降低相关联。

Visualization of ASAH1^?/?Endolysosomal Compartments by Cryo-ET.

LysoIP验证ASAH1^?/?HeLa溶酶体富集内溶酶体标志蛋白，脂质组显示溶酶体神经酰胺（ceramide）约3倍升高，BMP（bis(monoacylglycerol)phosphate）若干种类上调，GM2/GM3轻度降低（≤2倍），符合ASAH1（酸性神经酰胺酶/acid ceramidase）缺失表型。cryo-ET显示对照内溶酶体具典型腔内膜及致密降解物；ASAH1^?/?内溶酶体肿胀、缺乏层状膜物质但含多个ILV（intralumenal vesicles），偶见向内出芽小泡及糖基化蛋白修饰ILV。表明ASAH1缺失引起内溶酶体超微结构异常及功能异常。

讨论与结论

研究人员构建了含23个LSD基因敲除的人胚胎干细胞工具包，并生成iN与iDA深度蛋白质组资源，绘制了基因型及神经元类型特异的细胞器与蛋白复合物脆弱性图谱；开发了整合实验验证与结构预测的Tier 1 PPI流程以识别复合物水平扰动。重点分析显示GBA1^?/?与ASAH1^?/?iDA中氧化磷酸化（OXPHOS）蛋白下调及突触囊泡融合蛋白减少，ASAH1缺陷致iDA突触前结构紊乱与钙发放降低，与帕金森病（Parkinson's Disease, PD）风险基因GBA1、ASAH1关联线粒体及突触缺陷的机制相呼应；ASAH1缺失溶酶体内神经酰胺累积、BMP上调、内溶酶体肿胀且缺典型腔内膜。该工具包及在线交互式蛋白质组查看器（https://wren.hms.harvard.edu/ProteomeLSDNeuron/）为LSD致病机制及细胞器脆弱性研究提供资源。作者指出局限含：使用完全缺失而非患者风险等位基因、单培养缺胶质细胞共培养、Tier 1 PPI分析未含低置信互作、cryo-ET在HeLa而非神经元中进行、全细胞裂解液可能漏检某些细胞器特异性细微变化，后续拟扩展至全部LSD基因并结合细胞器分馏组学深入解析。