综述：冷冻电子叠层成像技术综述：生物学应用与未来前景

《Current Opinion in Structural Biology》：A comparative review of cryo-electron ptychography: Biological applications and future perspectives

　　

李守清|李学明

中国北京100084，清华大学生命科学学院，教育部蛋白质科学重点实验室

电子叠层成像是一种先进的四维扫描透射电子显微镜技术，通过计算相位反演，在材料科学领域能够以超高分辨率展现原子结构，同时对于对辐射敏感的生物样本也有应用潜力。近年来，混合像素阵列探测器和计算算法的进步使得低剂量成像成为可能，从而实现了对冷冻水合生物样本的成像，这种技术被称为冷冻电子叠层成像。然而，低剂量限制以及计算和实验设置上的复杂性等挑战，目前仍制约着冷冻电子叠层成像的广泛应用，也限制了其分辨率进一步提升到亚纳米级别。本综述介绍了冷冻电子叠层成像的进展，指出了生物样本与耐辐射样本之间的差异所在，并评估了未来在算法和硬件方面的发展潜力，这些进展有望提升该技术用于生物大分子及原位亚细胞结构分析的能力。

引言

扫描透射电子显微镜（STEM）和相位对比透射电子显微镜（PTEM）是透射电子显微镜中用于原子级成像的基本技术。在生命科学领域的冷冻电子显微镜应用中，PTEM仍然是主要技术基础，而在材料科学领域，随着像差校正器的广泛使用，STEM已逐渐取代了PTEM[1, 2, 3]。不过，在结构生物学领域，人们也曾尝试将STEM技术应用于分子质量测定以及未染色大分子组装体的质量分析，这是在现代冷冻电子显微镜得到普遍应用之前的做法[4, 5, 6]。近年来，高速混合像素阵列探测器的发展为四维STEM技术的应用奠定了基础[7,8]。在各种四维STEM技术中，叠层成像技术因能充分利用电子衍射信息且不受物镜限制，而具备出色的分辨率，因而脱颖而出[9]。随着低剂量成像技术的进步，叠层成像及其他四维STEM技术现已可用于冷冻水合生物样本的成像，在图像对比度[10,11]和剂量效率[12]方面具有优势。

相比之下，PTEM则面临着物镜对比度传递函数中分辨率与对比度之间固有矛盾带来的挑战，而足够的对比度和分辨率则是观察小型生物大分子和复杂亚细胞结构的关键因素[13]。为满足这些需求，人们开发出了多种先进且昂贵的技术，如直接电子探测器[14,15]、相位板[16, 17, 18]以及聚焦离子束铣削系统[19]。

作为典型的四维STEM技术，叠层成像在解决对比度与分辨率的矛盾方面具有显著优势。然而，其在生物样本中的应用仍处于初期阶段，其单粒子分析的分辨率远低于传统冷冻电子显微镜。此外，目前也尚未形成适用于生物样本三维重建的成熟技术方法。本综述首先介绍并比较了叠层成像与其他四维STEM技术，随后阐述了其在生命科学领域的潜在应用，并根据现有研究分析指出了未来需要发展的方向。

章节节选

STEM、4D-STEM与PTEM

STEM和4D-STEM都是通过会聚电子束以光栅方式扫描样本进行成像的（图1a和b），这与PTEM所采用的单一平行光束照明方式（图1c）有两个关键区别：其一，成像区域是通过扫描偏转器来控制的；其二，这类技术是基于会聚束电子衍射模式进行间接计算成像的。前者使得成像区域与探测器像素数量分离，这一特点尤其有利

突破分辨率极限的计算成像技术

在PTEM中，可实现的分辨率主要由物镜的成像参数决定。为了获得冷冻水合生物样本的最佳对比度，往往需要使用微米级的失焦设置，这就导致其常规分辨率远远低于在材料科学领域的应用水平。而叠层成像则通过关闭物镜来规避这些限制，它可以直接在远场捕获衍射图案，进而形成图像

叠层成像重建算法

叠层成像通过用计算算法替代透镜系统来实现成像功能。由于无需透镜，衍射现象可以通过夫琅禾费远场传播实现，因此叠层成像本身就具备无透镜成像的能力。在叠层成像中，信息传递主要依赖于算法处理而非透镜系统[49]。鉴于计算方法的重要性（见表1），我们将现有的叠层成像算法分为三类

高速混合像素阵列探测器

HPAD是实现4D-STEM和叠层成像所需的关键硬件。扫描阵列中的扫描位置数量往往高达数十万，因此需要具备每秒数千甚至数百万帧的高速摄像机，这样才能保证成像效率并减少样本移动带来的影响。传统的电荷耦合器件和单片主动像素传感器通常只能达到每秒数十到数百帧的速率，因此无法满足需求

叠层成像在生物应用领域的启示

随着低剂量技术和HPAD的发展，包括叠层成像在内的4D-STEM技术正在被应用于对辐射敏感的生物样本。目前已有的一些应用不仅展现了生物学领域中低剂量成像所面临的挑战，同时也凸显了该技术在图像对比度和电子剂量效率方面的优势。尽管以下讨论的所有研究并非严格意义上的叠层成像，但它们都提供了有价值的见解，有助于推动该技术进一步发展

讨论

冷冻电子叠层成像在生物样本成像方面展现出巨大潜力，其优势主要体现在能够克服PTEM中存在的对比度与分辨率之间的矛盾。该技术有望用于小型蛋白质的结构解析以及细胞结构的原位可视化。此外，由于采用了会聚电子探针，该技术还具有一定的深度分辨能力，且对厚样本的适应性更强，这为相关研究提供了新的发展方向

利益冲突声明

作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了以下机构的资助：国家自然科学基金委员会（X.L.的资助编号为32430056）、国家关键研发计划（X.L.的资助编号为2024YFA1307302）、清华-北大联合生命科学中心、北京生物结构前沿研究中心以及深圳医学科学院转化研究院（SMART）。