基于1H-NMR波谱技术的高低转移潜能人黑色素瘤细胞系代谢谱分析

《PLOS One》：Metabolic profiling of human melanoma cell lines with high and low metastatic capacity by 1H-NMR spectroscopy

　　

背景：黑色素瘤因其高度转移潜能和死亡率而成为最具侵袭性的皮肤癌类型之一。尽管黑色素瘤代谢重Programming（metabolic reprogramming，代谢重编程）的认识已取得进展，但代谢改变与转移潜能之间的关联仍不完善。

目的：本研究旨在表征高转移潜能（HT168-M1）和低转移潜能（WM983B）人黑色素瘤细胞系的代谢谱，并将二者相互比较，同时与正常人成纤维细胞（MRC-5）的代谢谱进行比较，以识别与转移行为相关的关键代谢物和代谢通路。

方法：研究人员采用¹H-核磁共振波谱（¹H-NMR spectroscopy）非靶向代谢组学方法，对三种细胞系的水溶性提取物进行代谢谱分析；利用多元统计分析，包括主成分分析（principal component analysis, PCA）和偏最小二乘判别分析（partial least squares-discriminant analysis, PLS-DA），识别差异代谢物，并通过通路分析确定发生改变的代谢网络。

结果：与成纤维细胞相比，黑色素瘤细胞中多条代谢通路显著改变，包括淀粉和蔗糖代谢、丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢以及谷胱甘肽代谢。浓度变化两倍以上的代谢物包括黑色素瘤细胞中升高的尿苷二磷酸葡萄糖（uridine diphosphate glucose, UDP-glucose, UDPG）、腺苷三磷酸（adenosine triphosphate, ATP）、甘油磷酸胆碱（glycerophosphocholine, GPC）、鸟苷三磷酸（guanosine triphosphate, GTP）、肌酸（creatine, Cr）和谷胱甘肽（glutathione, GSH），而成纤维细胞中葡萄糖（glucose, Glc）、谷氨酰胺（glutamine, Gln）和1-甲基烟酰胺（1-methylnicotinamide, MNA）水平降低。对不同转移潜能黑色素瘤细胞系代谢物的比较显示，牛磺酸（taurine）、次牛磺酸（hypotaurine）、β-丙氨酸（β-alanine, β-Ala）、谷胱甘肽和氨基酸代谢发生改变；浓度变化最大的代谢物为UDPG、GSH、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide, NAD⁺）、丙氨酸（alanine, Ala）和β-Ala。

结论：代谢组学分析揭示了黑色素瘤与正常成纤维细胞之间、以及低转移与高转移潜能黑色素瘤细胞之间存在明显不同的代谢重编程。黑色素瘤代谢的关键特征表现为糖酵解增强和谷胱甘肽依赖性抗氧化防御增强，而高转移潜能细胞呈现出更强的氧化还原适应能力和氨基酸利用方式的改变。GSH和谷氨酸（glutamate, Glu）水平升高，伴随NAD⁺和丙酮酸（pyruvate, Pyr）水平降低，提示其代谢模式向氧化应激抵抗和在高能量需求下存活的方向转变。

黑色素瘤起源于黑色素细胞，是侵袭性最强的皮肤恶性肿瘤之一。鉴于远处转移患者5年相对生存率明显低于局部病变，而有效抗转移疗法仍缺乏，深入认识转移性癌细胞的代谢特征至关重要。肿瘤细胞即使在氧充足时也偏向糖酵解供能（Warburg效应），乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）升高导致乳酸堆积；转移进展还需增强线粒体功能、谷氨酰胺分解（glutaminolysis）和脂肪酸氧化。谷氨酰胺不仅供能，更是谷胱甘肽、核苷酸及脂质合成的重要前体。目前，黑色素瘤代谢重编程与其转移潜能之间的系统关联仍不完全清楚。

为填补这一空白，研究人员选择高转移潜能HT168-M1与低转移潜能WM983B黑色素瘤细胞系，并以正常人肺成纤维细胞MRC-5为对照，利用¹H-NMR波谱非靶向代谢组学比较三者的水溶性代谢物谱。HT168-M1源自A2058并经体内肝转移筛选，WM983B来自淋巴结转移灶，二者均携带BRAF V600E突变并高表达缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor 1 alpha, HIF-1α）。研究旨在识别驱动转移行为的关键代谢物和代谢通路，为理解黑色素瘤进展提供代谢层面的证据，相关成果发表于《PLOS One》。

研究所用样本队列为43个独立细胞培养物，包括HT168-M1、WM983B和MRC-5（分别为16、16、11个生物学重复）。经冻融裂解和甲醇-氯仿-水三相萃取获得水溶性代谢物后，采用约600 MHz ¹H-NMR及二维同核全相关谱（total correlation spectroscopy, TOCSY）采集信号；谱图经分箱积分、总和归一化及自标度化处理后，以MetaboAnalyst 6.0进行主成分分析（PCA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA），并以变量投影重要性（variable importance in projection, VIP）评分筛选差异代谢物，最后基于京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）数据库开展代谢通路分析（Metabolic Pathway Analysis, MetPA）。

（一）代谢物鉴定：结合人类代谢组数据库（Human Metabolome Database, HMDB）化学位移信息和二维¹H-¹H-TOCSY谱，研究人员从三种细胞系水溶性提取物中共鉴定出47种代谢物，构成后续差异分析的基础。

（二）多元统计分析：PCA和PLS-DA均清晰区分各细胞系对，模型经十折交叉验证显示R²>0.98、Q²>0.88。与MRC-5相比，WM983B与HT168-M1中葡萄糖、谷氨酰胺及1-甲基烟酰胺降低，而UDP-葡萄糖、ATP、甘油磷酸胆碱、GTP、肌酸和谷胱甘肽升高；HT168-M1相对WM983B则表现为谷胱甘肽、谷氨酸和UDP-葡萄糖升高，肌酸磷酸（creatine phosphate, CrP）、丙氨酸、β-丙氨酸、天冬酰胺、牛磺酸及次牛磺酸降低。

（三）代谢通路分析：与正常成纤维细胞相比，黑色素瘤细胞显著受影响的通路包括淀粉和蔗糖代谢、丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢和谷胱甘肽代谢；WM983B还涉及β-丙氨酸、丙酮酸、精氨酸和脯氨酸代谢，HT168-M1还涉及芳香族氨基酸、烟酸和烟酰胺代谢。两黑色素瘤细胞系之间，牛磺酸和次牛磺酸代谢、谷胱甘肽代谢以及多种氨基酸代谢改变最为突出。

讨论部分进一步对上述结果进行了解释。在正常与黑色素瘤细胞系的比较中，黑色素瘤细胞呈现典型有氧糖酵解表型，葡萄糖消耗和乳酸生成增加，同时伴随ATP、磷酸胆碱、天冬氨酸、鸟氨酸及UDP-葡萄糖升高，提示膜合成、核苷酸合成、多胺代谢及细胞外基质重塑增强。谷氨酰胺与焦谷氨酸在MRC-5中更高，而黑色素瘤细胞谷胱甘肽升高，表明谷氨酰胺被更多地用于氧化还原稳态维持与谷胱甘肽合成。HT168-M1还显示苯丙氨酸和色氨酸降低、1-甲基烟酰胺及甘油磷酸胆碱升高，提示芳香族氨基酸和烟酰胺代谢紊乱，可能影响mTORC1信号及肿瘤免疫微环境。

在高转移与低转移黑色素瘤细胞系的比较中，差异主要集中在谷胱甘肽代谢和丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢。HT168-M1中谷胱甘肽和谷氨酸升高、焦谷氨酸与丙酮酸降低，显示其通过增强抗氧化能力以抵抗活性氧损伤；丙氨酸、天冬酰胺、肌酸磷酸和NAD⁺降低则反映高能量消耗和活跃的蛋白质合成。WM983B中牛磺酸、次牛磺酸及部分氨基酸水平更高，可能与低转移表型下的抗氧化状态有关。此外，UDP-葡萄糖水平从MRC-5、WM983B到HT168-M1逐步升高，提示其与转移潜能呈正相关。这些结果与以往黑色素瘤转移模型的代谢组学研究总体一致，具体差异可归因于细胞系和分析平台的不同。

研究结论：
本研究的代谢组学分析揭示了正常成纤维细胞与黑色素瘤细胞系之间、以及低和高转移潜能黑色素瘤细胞之间存在显著不同的代谢重编程。结果显示糖酵解增强和谷胱甘肽依赖性抗氧化防御是黑色素瘤代谢的关键特征，高转移潜能细胞表现出更强的氧化还原适应能力和氨基酸利用改变。谷胱甘肽和谷氨酸水平升高、NAD⁺和丙酮酸水平降低，提示细胞代谢向氧化应激抵抗及在高能量需求下存活的方向转变。鉴于研究仅使用两种细胞系且为体外条件，未来需整合更大规模队列、多组学策略和体内验证以进一步确认并拓展这些发现。