《Human Pathology》：Prognostic relevance and molecular correlates of Claudin-1 expression in pancreatic neuroendocrine tumors
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胰腺神经内分泌肿瘤（pNETs）是一类生物学异质性肿瘤，临床结局差异显著。当前预后评估主要依赖有丝分裂计数和Ki-67指数，但可能受肿瘤内异质性和取样偏倚影响。因此亟需额外生物标志物以完善风险分层并刻画侵袭性疾病生物学特征。研究人员探究了紧密连接蛋白Claud
胰腺神经内分泌肿瘤（pNETs）是一类生物学异质性肿瘤，临床结局差异显著。当前预后评估主要依赖有丝分裂计数和Ki-67指数，但可能受肿瘤内异质性和取样偏倚影响。因此亟需额外生物标志物以完善风险分层并刻画侵袭性疾病生物学特征。研究人员探究了紧密连接蛋白Claudin-1（CLDN1）在pNETs中的预后和生物学意义，该蛋白参与上皮性肿瘤进展。CLDN1表达通过组织芯片免疫组织化学在67例手术切除pNETs中评估。数据驱动的截断值（H-评分>50）识别出CLDN1高表达亚群，其与显著更短的无病生存期（p = 0.009）及不良临床病理特征相关。为明确CLDN1过表达背后的分子程序，研究人员通过倾向评分匹配22例关键临床变量匹配的肿瘤进行RNA测序（RNA-seq）。CLDN1高表达肿瘤显示内分泌谱系标志物减弱及外分泌和胎儿导管转录程序富集。细胞起源去卷积进一步揭示从内内分泌α/β细胞身份向导管样或腺泡样状态的转变。转录组聚类显示CLDN1高表达pNETs与胰腺导管腺癌（PDAC）谱存在部分趋同。此外，CLDN1高表达肿瘤表现出上皮-间充质转化（EMT）、HIPPO信号通路及免疫相关通路的激活，同时伴随基质和免疫细胞浸润增加。综合而言，研究发现CLDN1可作为生物学独特且临床侵袭性pNET亚群的标志物，其特征为去分化、谱系可塑性和肿瘤微环境重塑，支持进一步评估CLDN1作为pNETs候选预后生物标志物和潜在治疗靶点。
## 一、研究背景与问题提出
胰腺神经内分泌肿瘤（pancreatic neuroendocrine tumors, pNETs）是仅次于胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）的第二大常见胰腺恶性肿瘤类型，起源于胰腺内分泌细胞，具有高度可变的临床结局。约半数患者在确诊时已属转移期，5年生存率不足 evapor8 低于30%。目前，pNETs的预后判定主要依据增殖活性指标，即有丝分裂计数和Ki-67增殖指数。世界卫生组织（WHO）消化系统肿瘤分类第5版将pNETs划分为G1、G2、G3三个病理级别，与患者生存相关。然而，肿瘤内部增殖活性存在异质性，基于有限活检材料的组织学分级准确性可能受损，这一局限性凸显了超越增殖参数、能深化预后分层和肿瘤生物学认知的额外生物标志物的必要性。
紧密连接蛋白家族成员Claudins在多种实体瘤中展现出作为生物标志物的潜力。该家族蛋白在正常组织中参与细胞极性、旁细胞通透性和上皮完整性维持；其表达失调，特别是Claudin-1（CLDN1），与多种恶性肿瘤的肿瘤进展和转移行为相关。在PDAC中，CLDN1常相对于正常导管上皮和胰腺上皮内瘤变过表达，其上调与侵袭性增强、上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）及不良预后相关。然而，针对pNETs中CLDN1表达的研究寥寥可数，鉴于pNETs与PDAC截然不同的生物学特性，以及Claudins在调控肿瘤侵袭性和肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）中的新兴作用，探究CLDN1在pNETs中的意义兼具时效性与相关性。
研究人员旨在评估CLDN1蛋白表达在pNETs中的预后意义，并探索其与肿瘤生物学的关联。研究首先通过免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）评估膜性CLDN1表达，分析其与临床结局的相关性；随后对匹配样本进行转录组分析，以识别与CLDN1表达相关的基因表达程序，包括细胞分化、谱系身份和肿瘤微环境组成等特征。
## 二、关键技术方法
研究纳入斯特拉斯堡大学医院2007至2018年间接受手术切除的74例pNET患者，从中筛选67例具备充足福尔马林固定石蜡包埋（formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE）材料的病例构建组织微阵列（tissue microarray, TMA）。每例肿瘤取样4个3 mm核心（2个肿瘤中心和2个肿瘤边缘）。研究人员采用兔抗CLDN1抗体在Ventana Benchmark ULTRA平台上进行IHC检测，参照HER2评分标准对膜性染色强度进行0-3+四级评分，计算H-评分（阳性肿瘤细胞百分比×对应强度评分）作为半定量指标。为控制临床偏混杂因素，研究运用R软件MatchIt包进行倾向评分匹配（propensity score matching, PSM），以CLDN1状态为结局、年龄/性别/病理分期/肿瘤分级/新辅助治疗/手术类型/功能状态/Ki-67指数类别为预测变量，采用1:1最近邻匹配法，最终获得11对匹配样本（n=22）用于RNA-seq分析。
RNA-seq采用NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit构建测序文库，Illumina平台双端测序。原始FASTQ数据经fastp质控后，使用STAR比对至GRCh38/hg38参考基因组， FeatureCounts获取基因读数，以每百万转录本（transcripts per kilobase million, TPM）标准化。差异表达分析采用limma包，筛选标准为名义p<0.05、错误发现率（false discovery rate, FDR）<0.25、倍数变化>1.5或<1/1.5。基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）采用clusterProfiler包，基于分子特征数据库（Molecular Signatures Database, MSigDB） curated 基因集。肿瘤微环境组成估算采用MCP-counter包，肿瘤纯度评估采用ESTIMATE包，10个癌基因通路特征评分采用GSVA包进行单样本GSEA（single-sample GSEA, ssGSEA）分析。细胞身份预测采用MOVICS包中最邻近模板预测（nearest template prediction, NTP）方法，基于Muraro等数据集的四类胰腺细胞型特征（α、β、腺泡、导管）。与PDAC的转录组相似性分析纳入The Cancer Genome Atlas（TCGA）中152例PDAC的RNA-seq数据，筛选肿瘤纯度>80%的27例高纯度样本，经sva包批次校正后，基于变异度最高的10%基因进行无监督层次聚类（欧氏距离，Ward法）。统计分析采用R v4.2.2，分类变量采用Fisher精确检验，连续变量采用Mann-Whitney U检验，相关性采用Spearman秩相关，生存分析采用Kaplan-Meier法和log-rank检验，Cox比例风险回归估计风险比（hazard ratio, HR）和95%置信区间（confidence interval, CI），通过系列log-rank检验确定最优截断值。
## 三、研究结果
### CLDN1蛋白表达具有异质性且与预后相关
CLDN1表达（H-评分）范围0-200（中位数=5；四分位距=0-75），呈右偏分布：60%肿瘤呈低水平或检测不到（H-评分≤10），少数呈高表达（H-评分≥150）。大多数肿瘤无或仅有微弱膜性CLDN1表达，而少数肿瘤表现为中度或强膜性染色，涉及大比例肿瘤细胞。全切片评估显示肿瘤内CLDN1表达空间一致性良好。正常胰腺腺泡和导管细胞可见微弱不完全膜性染色。
通过H-评分递增联合log-rank检验确定临床意义截断值，H-评分>50产生最显著的无病生存期（disease-free survival, DFS）分层（p = 0.009），对应最小log-rank p值。CLDN1高表达组（n=11）中位DFS为112个月，而低表达组（n=56）未达到中位DFS。10年时间依赖性受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）分析支持该截断值（敏感度=0.79，特异度=0.55，曲线下面积area under the curve, AUC=0.73）。11例CLDN1高表达肿瘤中2例（18%）为G3级，较CLDN1低表达组（3.6%）富集5倍，但未达统计学显著性（p=0.156）。单因素Cox回归中，CLDN1高表达组癌症特异性死亡风险增加（HR=4.17；95%CI, 1.31-13.28, p=0.016），但在校正肿瘤分期和分级的多变量模型中，CLDN1未保留为独立预后因素。
### 倾向评分匹配后的转录组分析揭示CLDN1相关分子特征
为减少临床混杂并分离CLDN1蛋白表达的转录效应，PSM选取11例CLDN1高表达和11例CLDN1低表达肿瘤，在年龄、性别、分期、分级、Ki-67指数、新辅助治疗、手术类型和功能状态等变量上达到平衡（均p>0.3）。差异表达分析识别CLDN1高表达组2,529个上调基因和606个下调基因，CLDN1转录本水平显著升高（倍数变化=3.2；p=0.003；FDR=0.042），且转录本与蛋白水平强相关（Spearman R=0.58, p=0.005）。值得注意，多个神经元标志物（如CHGB、SYP）在CLDN1高表达肿瘤中显著下调。GSEA支持分化状态转变：β细胞和α细胞身份相关通路显著下调，而胎儿导管和外分泌谱系程序相关基因集在CLDN1高表达组上调。
### CLDN1高表达pNETs展现向外分泌细胞身份的转变
为进一步评估观察到的内分泌特征丧失，研究人员应用NTP方法基于Muraro单细胞参考数据推断四类胰腺谱系（α、β、腺泡、导管）的细胞起源身份。CLDN1高表达肿瘤中11例中有7例（64%）预测来源于外分泌谱系（4例导管，3例腺泡），而所有11例CLDN1低表达肿瘤均归类为内分泌来源（9例α，2例β）（p=0.004）。
为验证该转变，研究人员对22例匹配pNETs和27例高纯度PDAC样本进行无监督聚类。基于高变异基因的三组转录群被识别：C1（n=14；全为PDAC）、C2（n=16；15例pNETs和1例PDAC）、C3（n=19；7例pNETs和12例PDACs混合）。值得注意的是，C3混合簇中所有7例pNETs均属CLDN1高表达组（100%），而pNET富集的C2簇中15例中有11例为CLDN1低表达（73%）（p=0.004）。RNA水平上CLDN1在C3中最高，其次C1，C2表达最低（p<0.001）。除CLDN1外，C3肿瘤还显示生长抑素受体基因（SSTR1、SSTR2、SSTR3）下调，伴随胎儿导管和外分泌谱系程序上调。GSEA进一步显示C3富集多个标志性通路，包括上皮-间充质转化、血管生成、免疫相关和增殖程序；C2则优先富集胰腺β细胞标志性特征，C1以代谢通路激活为特征。由于TCGA PDAC的DFS数据大量缺失，以总生存期为替代指标显示C2预后最佳，C1和C3共享相似的较差结局（p=0.0009）。
### CLDN1高表达pNETs中的癌基因通路激活与肿瘤微环境重塑
鉴于CLDN1高表达组观察到的较差预后，研究人员探索其与癌基因信号通路的关联。10个经典通路评估中，CLDN1高表达肿瘤显示细胞周期、HIPPO、NRF2和WNT通路显著上调（均p<0.05）。由于这些通路已知可塑造肿瘤微环境，研究进一步应用MCP-counter分析，揭示CLDN1高表达肿瘤在免疫细胞（T细胞、B细胞）和基质成分（成纤维细胞、内皮细胞）中均显著富集。
## 四、讨论与结论
研究人员在讨论中首先阐述了研究的方法学考量：膜性CLDN1免疫反应性（包括完全和部分膜性染色）被视为生物学有意义，而胞质染色被刻意排除分析。这一选择与CLDN1在细胞膜的初级功能角色、以及作为治疗性单克隆抗体靶点的细胞膜表达CLDN1的临床转化价值一致，其评分策略类比于HER2等治疗相关细胞表面蛋白的常规应用，有助于提高可重复性和临床可解释性。
与既往Borka等在20例肿瘤中未发现CLDN1显著表达的研究不同，研究人员认为样本量限制、以及本队列中CLDN1高表达病例在G3肿瘤和不良临床病理特征中的富集，可能解释了这一差异，提示CLDN1表达可能在更具侵袭性的pNET亚群中特异性上调。
研究将CLDN1识别为pNETs的新型预后标志物，高膜性表达与更短无病生存期相关。通过整合转录组分析，研究证实CLDN1高表达肿瘤展现出去分化特征、向外分泌谱系身份的偏移以及肿瘤微环境的实质性重塑。这些发现支持CLDN1作为侵袭性肿瘤生物学替代指标和pNETs风险分层中的潜在价值。
数据提示，在pNETs中，CLDN1高表达可能标志着从经典内分泌分化程序向外分泌和导管表型的偏离，这不仅是一种分子现象更具有临床意义：CLDN1高表达肿瘤在G3肿瘤中占比过高，且在无监督转录组分析中与PDAC样本聚类；同时显示HIPPO信号通路和EMT等可驱动肿瘤进展和治疗抵抗的通路富集。这些观察共同提示CLDN1表达可能定义了一种去分化和潜在更具可塑性的pNET亚型。
CLDN1与改变肿瘤微环境的关联是研究的另一关键发现。CLDN1高表达肿瘤显示免疫细胞和基质细胞群体浸润增加，包括T细胞、NK细胞、中性粒细胞、成纤维细胞和内皮细胞。这可能反映CLDN1表达塑造或被微环境信号所塑造，促进免疫逃逸或肿瘤支持性基质。尽管CLDN1多变量分析中未保留为独立预后因素，可能因其与高分级等已知不良特征的共线性，但其转录组和微环境的独特性支持其作为超越当前组织病理学分级的生物学侵袭性标志物。临床上，CLDN1 IHC可补充Ki-67和有丝分裂计数以改善预后判定，尤其在活检材料有限或增殖指数不明确时。
除预后价值外，研究强调CLDN1作为pNETs潜在治疗靶点。其膜定位和侵袭性pNETs中的过表达为抗体药物偶联物（antibody-drug conjugates, ADCs）等靶向方法提供了概念框架。CLDN1近期已作为ADC靶点在其他上皮癌中获得关注（如NCT06747585），支持研究发现的转化相关性。因此，CLDN1免疫组织化学可能不仅作为结局预测标志物，还可作为伴随诊断指导未来CLDN1导向治疗的患者选择。
从更宏观视角，研究发现与pNETs包含转录和生物学多样性亚型的观点一致，可能反映不同的细胞起源或肿瘤演化轨迹。CLDN1高表达pNETs与PDAC样特征的部分趋同，提出部分pNETs在进展中可能采纳导管程序的假说，挑战了内分泌和外分泌胰腺肿瘤之间的传统二分法。
研究局限性包括：转录组队列样本量相对较小，需要在独立队列中验证；分析基于 bulk RNA-seq 和TMA，无法完全解析空间结构或细胞异质性；单细胞和空间转录组方法将有助于精确剖析CLDN1表达、谱系可塑性和肿瘤微环境之间的关系。
研究结论指出：高CLDN1表达识别出一类具有不良临床结局、外分泌谱系重编程和改变肿瘤微环境的pNET亚群。CLDN1可作为去分化和基质激活的替代标志物，凸显其在改善风险分层和揭示pNETs新型治疗脆弱性方面的潜在价值。
