通过整合多组分的尿液长非编码RNA分析（包括细胞内、无细胞以及细胞外囊泡），利用传统标志物之外的方法，更精准地鉴别经活检确诊的糖尿病性肾病与非糖尿病性肾病

《BMJ Open Diabetes Research & Care》：Integrated multicompartment urinary long non-coding RNAs profiling (cellular, cell-free, and extracellular vesicle) for better differential diagnosis of biopsy-proven diabetic and non-diabetic kidney disease beyond conventional markers

　　摘要
引言：2型糖尿病（T2DM）引起的肾脏损害可能源于糖尿病本身，即糖尿病肾病（DKD），也可能由非糖尿病因素引起，即非糖尿病肾病（NDKD），或者两者兼有（混合性肾病）。现有的临床和实验室指标在预测诊断结果（金标准为肾活检）方面存在局限性。长非编码RNA在临床前模型中已被研究，但在经活检确诊的T2DM肾病中尚未得到探索。本研究旨在确定DKD与NDKD相比是否存在长非编码RNA的表达差异。

研究设计与方法：通过数据库搜索预选出可用于人类研究的長非编码RNA。在发现组中，对经活检确诊的DKD、NDKD、无肾病的T2DM患者以及健康受试者的尿液中的三种成分（尿细胞、尿外泌体及无细胞尿）中的预选长非编码RNA进行检测。在所有样本中均表现出显著差异的长非编码RNA进一步在肾组织中进行了检测，并通过接收者操作特征曲线评估其诊断性能。在验证组中，对发现组中表现最佳的長非编码RNA在独立样本中进行检测。此外还评估了这些长非编码RNA在临床决策中的应用价值。

结果：在发现组中，DKD患者的所有尿液成分中MALAT1和PVT1的水平均存在差异，且肾活检组织中的水平也有所升高。其中MALAT1的表现最为稳定。来自尿细胞的MALAT1在区分DKD与NDKD方面具有最高的准确性（ΔCt<8.3，灵敏度90%，特异性89.6%，比值比53.9，p<0.0001）。在验证组中，来自尿细胞的MALAT1的灵敏度为90%，特异性为88.5%。在临床应用方面，将MALAT1加入现有的DKD与NDKD的临床/生化鉴别指标中，可提升诊断的准确性，净重新分类改善值为0.53：64%的DKD患者被正确归类为更高患病概率组（NRI+ = 0.280），62.5%的NDKD对照组被正确归类为更低患病概率组（NRI? = 0.250）。

结论：与现有临床和生化指标相比，来自尿细胞的MALAT1能更有效地区分DKD与NDKD。

已有研究进展：2型糖尿病引起的肾脏损害可能源于糖尿病肾病，也可能由非糖尿病因素导致，如IgA肾病、肾小球肾炎、高血压性肾硬化等，这些情况统称为非糖尿病肾病，或者两者同时存在（混合性肾病）。目前，肾活检仍是区分DKD与NDKD的金标准。现有的临床标志物在筛选可能需要肾活检的受试者方面存在不足。NDKD患者若能接受针对性治疗，有望改善预后。在多种分子标志物中，包括长非编码RNA在内的非编码RNA被视为具有潜力的疾病生物标志物。已有研究表明，糖尿病和肾病模型中长非编码RNA的表达存在变化，但基于人类样本的研究，尤其是经活检确诊的DKD和NDKD病例的研究仍较为有限。

本研究贡献：本研究中发现，来自尿细胞的MALAT1这一长非编码RNA（ΔCt<8.3）能够以90%的灵敏度和89.6%的特异性区分DKD与NDKD，且其比值比高达53.9（p<0.0001）。在独立验证组中，该指标的灵敏度为90%，特异性为88.5%。将MALAT1纳入现有指标体系后，可进一步提升DKD与NDKD的区分能力，从而更精准地辅助临床决策，净重新分类改善值为0.53：64%的DKD患者被正确归类为更高患病概率组，62.5%的NDKD对照组被正确归类为更低患病概率组。在4年随访数据的分析中，出现肾脏功能不良结局的受试者其基线时MALAT1的表达水平明显高于未出现此类结局的受试者。

本研究对研究、实践或政策的潜在影响：与现有临床和生化指标相比，来自尿细胞的MALAT1能更有效地区分DKD与NDKD。此外，那些空腹血糖低于100毫克/分升、餐后血糖低于140毫克/分升、糖化血红蛋白低于5.7%，且没有肾脏受累迹象（尿白蛋白/肌酐比值低于30毫克/克，肾小球滤过率高于90毫升/分钟/1.73平方米）的血糖正常者被纳入健康对照组。所有四组——糖尿病肾病组、非糖尿病肾病组、无肾脏疾病的2型糖尿病组以及健康对照组——的临床、人口统计学和生化指标均被记录下来。从所有四组的受试者身上收集了50毫升的尿液样本，即经活检确诊的糖尿病肾病组和非糖尿病肾病组，以及相应的对照组，包括无肾脏疾病的2型糖尿病患者和健康对照组。按照制造商的说明（Zymo Research，产品编号R1039，美国），从30毫升尿液中分离出的尿液细胞中提取总RNA。在以3000转/分钟的速度离心后得到的2毫升尿液上清液中，根据实验室的标准流程（Takara的RNAiso Plus，产品编号9190），使用TRIzol方法提取无细胞RNA。外泌体则是使用总外泌体分离试剂（Thermo Fisher）从尿液中分离出来，并通过纳米粒子追踪分析进行表征，同时还通过原子力显微镜进一步验证（见在线补充数据）。外泌体中的RNA也是用TRIzol方法（RNAiso Plus，Takara）提取的。提取出的RNA的数量和质量是通过Eppendorf生物光谱仪测量260纳米和280纳米处的吸光度来评估的。A260/A280比值约为2.0的样本被认为纯度较高，会被纳入研究范围。根据制造商的流程，使用PrimeScript 1st Strand cDNA合成试剂盒（Takara Bio），在20微升的最终反应体积中，以100纳克的RNA为原料进行逆转录反应。定量实时PCR技术则用于检测预先选定的尿液长链非编码RNA的表达水平，检测过程中采用SYBR Green染料，分析设备为Applied Biosystems Quant Studio 3系统。18S基因作为内源对照基因。表达水平是通过对ΔCt值进行计算得出的，其中ΔCt值为目标基因的循环阈值减去内源基因的循环阈值，ΔCt值越小表示该基因的表达水平越高。相对表达量（倍数变化）则是通过2?ΔΔCt方法确定的。在以内源基因为基准对样本中的目标长链非编码RNA的相对表达量进行标准化处理后得出。肾脏组织中的长链非编码RNA表达情况在全面分析尿液后，那些表达有显著变化的长链非编码RNA会在肾脏组织中进行进一步检测。同样按照制造商的说明（Zymo Research，产品编号R1007），从肾脏活检组织切片中提取总RNA。随后再使用实时PCR技术来检测这些长链非编码RNA的表达水平，具体方法与之前描述的一致。这些长链非编码RNA的临床应用价值及诊断潜力也得到了评估，那些表现显著的分子会在另一个独立队列中进一步验证。验证队列该验证队列由该研究所肾脏科中经组织病理学诊断为糖尿病肾病或非糖尿病肾病的连续受试者组成。这一独立的糖尿病肾病/非糖尿病肾病受试者群体是根据与发现队列相同的纳入和排除标准招募的。其组织病理学分类标准也与发现队列一致。验证队列中的长链非编码RNA表达情况在发现队列中表现最为稳定且效果最佳的那些长链非编码RNA会在验证队列中再次接受检测，同时还会与目前常用的临床预测因子相比，评估它们在区分糖尿病肾病与非糖尿病肾病方面的临床应用价值。随访研究（探索性）对于那些经活检确诊为糖尿病肾病的受试者，每隔3个月进行一次随访，从活检之日起共4年内持续记录他们的肾小球滤过率和蛋白尿情况。随访研究的设计如图2所示。这些受试者的肾脏综合结局也会被评估。肾脏综合结局的定义包括肌酐水平翻倍（两次独立的肌酐水平测定结果显示肾小球滤过率下降超过57%，两次测定之间至少间隔30天）、进展为终末期肾病（至少在两次间隔30天以上的独立测定中，肾小球滤过率持续低于15%，无论是否接受维持性血液透析或肾移植治疗）以及因慢性肾脏病并发症导致的死亡（那些即便符合指征但并未接受肾脏替代治疗的患者的死亡情况）。进一步的分析比较了出现肾脏综合结局的受试者与未出现此类结局的受试者之间的长链非编码RNA表达差异。样本量发现队列样本量的计算是使用MedCalc软件V.19.5.6（免费在线试用版）完成的。假设错误概率为0.05，检验功效为80%，对应于零假设下的曲线下面积为0.5，而期望的区分性能对应的曲线下面积为0.7。基于这些假设，每个组至少需要的受试者数量被估算为40人，用于构成发现队列。验证队列用于比较比例的验证研究中的样本量，是在错误概率为0.05、检验功效为90%的前提下计算得出的。鉴于已知的两组比例差异为66%对比20%，计算出的样本量为46人。统计分析首先使用Kolmogorov-Smirnov检验来判断数据是否呈正态分布。分类变量则以频率和百分比的形式呈现。对于涉及两个以上组的非参数比较，采用Kruskal-Wallis检验；而对于两个独立组之间的比较，则使用Mann-Whitney U检验。为了确定长链非编码RNA的临界值（ΔCt值），从而能够区分糖尿病肾病与非糖尿病肾病，还进行了接收者操作特征曲线分析。此外，还通过二元逻辑回归分析来识别糖尿病肾病的预测因子。在构建模型时，会筛选出在糖尿病肾病与非糖尿病肾病两组之间存在显著差异的协变量（设定的p值阈值较低，为小于0.1），并且这些协变量在两组间的差异上具有生物学合理性。与非糖尿病肾病相比，用于预测糖尿病肾病的协变量包括患病后的糖尿病持续时间、是否存在视网膜病变、是否存在血尿、蛋白尿以及低密度脂蛋白水平。还会对各类协变量之间进行相关性分析，同时计算方差膨胀因子以评估多重共线性问题。如果方差膨胀因子值大于5，则表明存在影响回归模型的多重共线性问题。在验证队列中，会将发现阶段确定的临界值应用于另一组经组织病理学确诊为糖尿病肾病或非糖尿病肾病的受试者身上，以此评估该临界值的预测价值。为了评估所发现的那些长链非编码RNA的独立诊断价值，我们采用了无类别净重分类改善值这一指标，将包含疾病持续时间、肾脏大小、蛋白尿、血尿和视网膜病变等信息的基础临床模型，与加入这些已识别长链非编码RNA的扩展模型进行比较。在随访研究中，各组之间的差异是通过Mann-Whitney U检验来评估的。对于结局的比例和风险比较，则使用χ2检验，而结局的预测因子识别则通过二元逻辑回归来完成。数据加工和分析工作则借助社会科学研究统计包（SPSS V.25）和R语言完成。研究结果发现队列该队列的构成从活检队列中依次纳入了那些经组织病理学确诊为糖尿病肾病和非糖尿病肾病的受试者。此外，还纳入了无肾脏疾病的2型糖尿病患者以及健康受试者作为对比组（每组共40个样本）。整个研究人群的平均年龄为51.34±7.6岁，其中60%为男性。健康对照组、无肾脏疾病的2型糖尿病组以及经活检确诊的糖尿病肾病组和非糖尿病肾病组的临床和生化指标对比情况详见表1以及在线补充表1。表1健康人群、2型糖尿病患者、糖尿病肾病患者及非糖尿病肾病患者的基线临床和生化指标（n=120）尿液各成分中的长链非编码RNA表达情况在所有四组的尿液细胞团中，都检测了候选长链非编码RNA的表达情况，相关结果总结见图3。与非糖尿病肾病组以及无肾脏疾病的2型糖尿病组相比，糖尿病肾病组中PVT1和MALAT1的表达水平显著升高（分别为p=0.0002、p<0.0001），而与后者相比，XIST的表达水平则在糖尿病肾病组中显著降低（p=0.04）。另外，GAS5在糖尿病肾病组中的表达水平也显著高于非糖尿病肾病组（p=0.02），不过与无肾脏疾病的2型糖尿病组相比则没有显著差异。图3需授权显示健康人群、无肾脏疾病的2型糖尿病患者、糖尿病肾病患者及非糖尿病肾病患者尿液细胞团中长链非编码RNA的表达情况。所有数据均以均值±标准误的形式呈现，两组间的比较采用Mann-Whitney U检验，四组间的比较则采用Kruskal-Wallis检验（ns：p>0.05，*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001，****p≤0.0001）。DKD指糖尿病肾病；NDKD指非糖尿病肾病；ns表示无显著差异；T2DM指2型糖尿病。无细胞尿液在所有组的无细胞尿液样本中，也都检测了某些长链非编码RNA的表达情况，结果汇总见图4。与非糖尿病肾病组以及无肾脏疾病的2型糖尿病组相比，糖尿病肾病组中PVT1的表达水平显著降低，而MALAT1的表达水平则显著升高（分别为p=0.0001、p<0.0001）；与后者相比，MIAT的表达水平在糖尿病肾病组中也有所改变（p=0.03），H19的表达水平则显著升高（p=0.001）。不过，GAS5在糖尿病肾病组中的表达水平却显著低于非糖尿病肾病组（p=0.001），与无肾脏疾病的2型糖尿病组相比则无显著差异。图4需授权显示健康人群、无肾脏疾病的2型糖尿病患者、糖尿病肾病患者及非糖尿病肾病患者尿液无细胞中的长链非编码RNA表达情况。所有数据均以均值±标准误的形式呈现，两组间的比较采用Mann-Whitney U检验，四组间的比较则采用Kruskal-Wallis检验（ns：p>0.05，*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001，****p≤0.0001）。DKD指糖尿病肾病；NDKD指非糖尿病肾病；ns表示无显著差异；T2DM指2型糖尿病。尿液外泌体在尿液外泌体中，也对一些优先检测的长链非编码RNA的表达情况进行了分析，结果总结见图5。值得注意的是，与非糖尿病肾病组以及无肾脏疾病的2型糖尿病组相比，糖尿病肾病组中MALAT1的表达水平显著升高（分别为p=0.0007、p=0.001），而PVT1的表达水平则在糖尿病肾病组中显著降低（分别对应p=0.002、p=0.0002）。此外，H19和OIP5在糖尿病肾病组中的表达水平也与无肾脏疾病的2型糖尿病组存在差异。不过，各组间尿液外泌体中GAS5的表达水平则无显著差异。图5需授权显示健康人群、无肾脏疾病的2型糖尿病患者、糖尿病肾病患者及非糖尿病肾病患者尿液外泌体中长链非编码RNA的表达情况。所有数据均以均值±标准误的形式呈现，两组间的比较采用Mann-Whitney U检验，四组间的比较则采用Kruskal-Wallis检验（ns：p>0.05，*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001，****p≤0.0001）。DKD指糖尿病肾病；NDKD指非糖尿病肾病；ns表示无显著差异；T2DM指2型糖尿病。尿液长链非编码RNA表达水平的比较在所分析的12种长链非编码RNA中，MALAT1和PVT1在尿液的三种成分中的表达水平均存在显著差异。MALAT1在尿液的三种成分——细胞组分、无细胞组分和外泌体组分——中的表达模式都较为一致且具有较好前景。长链非编码RNA分析结果显示，在所有被分析的长链非编码RNA中，MALAT1的表达水平从健康对照组逐渐升高到无肾脏疾病的2型糖尿病组，而从后者再进一步升高到糖尿病肾病组，在尿液的三种成分中，糖尿病肾病组中的MALAT1表达水平均显著高于非糖尿病肾病组。相比之下，PVT1在糖尿病肾病组中的表达水平虽然与非糖尿病肾病组及无肾脏疾病的2型糖尿病组相比都有显著变化，但其变化趋势并不一致。肾脏组织为了确认那些表达水平发生显著变化的长链非编码RNA确实来源于肾脏本身，又在肾脏组织中检测了MALAT1和PVT1的表达水平（见图6）。与非糖尿病肾病组相比，糖尿病肾病组中这两种长链非编码RNA的表达水平均显著升高，MALAT1的升高值为p=0.004，PVT1的升高值为p=0.004，这一结果证实了这些长链非编码RNA确实起源于肾脏。图6需授权显示糖尿病肾病患者和非糖尿病肾病患者肾脏组织中长链非编码RNA的表达情况。所有数据均以均值±标准误的形式呈现，组间比较采用Mann-Whitney U检验（ns：p>0.05，*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001，****p≤0.0001）。DKD指糖尿病肾病；NDKD指非糖尿病肾病；ns表示无显著差异。发现队列中临界值的确定及临床性能分析针对尿液细胞团、无细胞尿液和外泌体中的MALAT1和PVT1，都进行了ROC曲线分析，以此判断它们在区分糖尿病肾病与非糖尿病肾病方面的能力。总结结果见图7。以尿液细胞团中MALAT1的ΔCt值小于8.3作为诊断糖尿病肾病的临界值时，该指标在区分糖尿病肾病与非糖尿病肾病方面显示出最高的灵敏度（90%）和最高的特异性（89.6%），对应的曲线下面积为0.95，95%置信区间为0.9到1，p值小于0.0001。图7需授权显示用于区分糖尿病肾病与非糖尿病肾病的ROC曲线分析。AUC代表曲线下面积；DKD指糖尿病肾病；NDKD指非糖尿病肾病；ROC代表接收者操作特征曲线。为了确定糖尿病肾病的组织病理学诊断预测因子，进行了二元逻辑回归分析，其中以糖尿病肾病与非糖尿病肾病的诊断结果作为因变量，以患病后的糖尿病持续时间、是否存在视网膜病变、是否存在血尿、蛋白尿以及低密度脂蛋白水平作为协变量。分析结果表明，MALAT1可能可以作为糖尿病肾病诊断的预测因子，其比值比值为53.9，95%置信区间为3.7到774.1，p值小于0.0001。验证队列在独立的验证队列中共有62名受试者，其中37人经活检确诊为糖尿病肾病，25人被诊断为非糖尿病肾病。表2展示了验证组患者的临床及基线特征总结。表2：验证组（n=62）的临床与生化指标。在该验证组中，利用从发现组确定的临界值，通过尿液细胞团提取的MALAT1可有效区分糖尿病肾病与非糖尿病肾病，其敏感度为88.5%，特异性为90%，表明MALAT1是区分这两种疾病的有效标志物。

MALAT1在临床决策中的应用
为评估MALAT1在区分糖尿病肾病与非糖尿病肾病方面的作用，研究人员将其与现有的临床及生化指标（包括疾病持续时间、肾脏大小、蛋白尿、血尿以及视网膜病变）进行了比较，同时还使用了包含MALAT1的扩展模型。加入MALAT1后的校正净收益值为0.530（95%置信区间为0.104至0.910），说明其显著提升了诊断准确性。具体而言，64%的糖尿病肾病病例被正确地重新分类为更高发病概率的病例（NRI+ = 0.280），而62.5%的非糖尿病肾病对照组患者也被正确地重新分类为较低发病概率的病例（NRI? = 0.250）。这些结果表明，与仅使用标准临床指标相比，MALAT1在准确判断患者病情方面具有显著的额外价值。

MALAT1与组织病理学指标的关联
为探讨尿液细胞团提取的MALAT1表达与组织病理学指标之间的潜在关联，研究人员采用了肯德尔tau-b分析方法。分析结果显示，MALAT1表达与多种组织病理学指标呈正相关，包括系膜扩张（r=0.424，p<0.001）、Kimmelstiel-Wilson病变（r=0.219，p=0.001）、小动脉玻璃样变（r=0.428，p<0.001），以及肾小管和肾小球基底膜增厚（分别为r=0.360，p=0.002和r=0.466，p<0.001）；同时与IgA（0.291，p=0.01）及轻度系膜细胞增生（r=0.304，p=0.009）呈负相关。

MALAT1与不良肾脏结局的关联（随访研究）
对糖尿病肾病患者进行了为期4年的随访，以观察其肾脏功能的综合表现。在完成随访的51名糖尿病肾病患者中，有32人出现了肾脏功能恶化，另有19人未出现此类情况。对比这两组患者的MALAT1基线表达水平，发现出现肾脏功能恶化的患者其MALAT1表达明显更高（见图8）。此外，通过逻辑回归分析，以是否出现肾脏功能恶化作为因变量，以MALAT1表达水平及糖尿病患病时长作为协变量，结果表明基线时的MALAT1表达水平可预测糖尿病肾病患者的肾脏结局（比值比=7.3，95%置信区间为1.2至41.66，p=0.025）。

图8：有无肾脏功能恶化的糖尿病肾病患者体内尿液细胞团提取的MALAT1表达情况。所有数据以均值±标准误的形式呈现，两组数据之间通过Mann-Whitney U检验进行比较（ns：p>0.05，*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001，****p≤0.0001）。DKD指糖尿病肾病。

讨论
本研究旨在分析尿液中表达的长链非编码RNA的特征。首先通过数据库搜索筛选出了12种长链非编码RNA。在经过评估的这些长链非编码RNA中，GAS5在无细胞尿液和细胞尿液中的表达存在变化，但在尿外泌体中则无此变化。而PVT1在所有类型的尿液中的表达均出现显著变化，但结果并不一致。值得注意的是，只有MALAT1在无细胞尿液、尿液细胞团、尿外泌体以及肾脏组织中都表现出一致的表达模式。因此，MALAT1有望成为一种有效的糖尿病肾病标志物，能够将其与无肾脏疾病的2型糖尿病以及非糖尿病肾病区分开来。MALAT1在肾脏组织中的表达进一步证实了其源自肾脏。在独立验证组中，使用从发现组确定的临界值，再次验证了这一结论，体现了研究结果的可靠性。MALAT1在临床决策中的诊断性能优于现有的分类模型，更能有效区分糖尿病肾病与非糖尿病肾病。通过对4年随访数据的进一步分析发现，与未出现肾脏功能恶化的患者相比，出现肾脏功能恶化的糖尿病肾病患者其基线MALAT1表达水平更高。

此前已有研究指出，这些预先筛选出的长链非编码RNA在体外细胞培养模型以及动物模型中都与糖尿病肾病存在显著关联，这表明它们可能参与了糖尿病肾病的发病过程。然而，那些临床前研究的结果在经活检确诊的糖尿病肾病患者中并未得到一致印证，而活检才是诊断糖尿病肾病的金标准。以往的研究还发现，1型糖尿病及肾脏疾病患者的尿液中MALAT1表达存在变化，同时，在无肾脏疾病的2型糖尿病患者以及糖尿病肾病患者中，其血液中的MALAT1表达水平也高于健康对照组。不过，这些研究仅依据尿白蛋白/肌酐比值和肾小球滤过率来定义糖尿病肾病，缺乏活检确诊的糖尿病肾病作为验证依据，也未纳入用于肾脏活检的常规临床预测指标，且仅限于糖尿病肾病与健康对照组之间的比较。据我们所知，目前尚无全面的研究针对经活检确诊的糖尿病肾病、非糖尿病肾病以及无肾脏疾病的2型糖尿病患者和健康个体等不同群体中的MALAT1表达情况进行分析。

此外，以往的研究大多是在外周血单核细胞、血浆或血清中检测这些长链非编码RNA的表达情况。虽然也有少数研究探讨了尿液中的长链非编码RNA，但关于涵盖所有尿液成分（即无细胞尿液、尿外泌体以及尿液细胞团）的全面分析数据仍然不足。循环尿液中的RNA含量相对较低，而且从外泌体中提取RNA既费力又耗时，这限制了其在临床实践中的应用。相比之下，尿液细胞团中含有较高水平的核酸，且受体液代谢因素的影响较小，因此可作为一种实用的、无创的长链非编码RNA来源。此前已有几项研究采用RNA测序等先进技术对长链非编码RNA进行无目标检测，但在这类研究中，以人类群体为研究对象的情况并不多见。尽管使用了成本高昂的先进技术，但许多已发现的長鏈非編碼RNA的临床应用潜力仍十分有限，这主要是因为缺乏在样本量充足的、经活检确诊的糖尿病肾病群体中的验证，而这种验证对于确定其临床意义至关重要。与之不同，我们的研究采用了系统性的数据库筛选方法，并借鉴了早期研究中关于MALAT1作为标志物作用的成果。

与以往仅报告长链非编码RNA表达差异而不进行深入统计分析的研究不同，本研究采用了ROC曲线分析、逻辑回归分析以及校正净收益值分析等稳健的统计方法，从而确定了MALAT1的临床重要性。我们意识到，校正净收益值这一指标在统计学上存在争议，一些批评者认为它容易受到模型设定不当的影响，而且当使用与模型训练相同的数据时，还可能存在高估其临床应用价值的倾向。不过，我们认为在本研究中采用校正净收益值是合理且可靠的，原因有以下几点。首先，为避免“乐观偏差”的影响，我们的校正净收益值指标是完全基于独立的验证组数据计算得出的，而非发现组数据，这确保了所观察到的重新分类结果反映了该生物标志物的真正通用性，而非统计上的偶然误差。其次，校正净收益值能够更细致地展示MALAT1是如何纠正那些原本被现有临床及实验室检测指标错误分类的患者的诊断结果的。值得注意的是，MALAT1不仅提升了糖尿病肾病的诊断准确性，也对非糖尿病肾病的诊断有帮助，这说明它在整个疾病谱系中都具有实用价值。

本研究具有多项显著优势：其一，它采用了经活检确诊的糖尿病肾病和非糖尿病肾病作为研究对象，而这正是诊断糖尿病肾病的金标准。此外，该研究还对尿液中的所有成分中的长链非编码RNA表达情况进行了全面分析，从而让我们能更全面地了解尿液中长链非编码RNA的特征。在所有候选标志物中，MALAT1表现出了最稳定且一致的表达模式，其表达情况的统一性进一步证明了它源自肾脏。另外，本研究将尿液细胞团作为一种实用、无创的RNA来源，这提升了该标志物的临床应用潜力，而初步的纵向研究数据还表明，MALAT1可能在预测肾脏功能结局方面具有预后价值。

对于大约三分之二的患有2型糖尿病且存在肾脏受累问题的患者来说，这项研究具有非常重要的意义，因为它有助于避免不必要的肾脏活检，更重要的是，它能够帮助筛选出那些可能从肾脏活检中获益的患者。不过，这项研究也存在一些局限性。由于它基于的是单中心研究群体，因此只能被视为概念验证。此外，尽管MALAT1表现出较强的诊断性能，但该研究对其在糖尿病肾病发病机制中的作用尚未给出足够的解释。由于尿液检测中存在RNA产量低以及检测结果易变异等技术难题，因此那些已被发现的長鏈非編碼RNA还需要在多中心、多国家、多种族的人群中进行大规模验证，同时还需要通过高通量分析技术来进一步提升它们的临床应用潜力，才能在临床实践中得到可靠应用。即便是一些探索性研究也表明，MALAT1与糖尿病肾病中的不良组织病理学变化以及较差的肾脏功能结局存在关联，这进一步支持了我们的研究结果；不过，仍需要开展样本量充足的纵向研究来进一步验证这些发现。

总结与结论
通过数据库搜索，我们找到了与糖尿病和肾脏疾病相关的長鏈非編碼RNA，随后在健康对照组、无肾脏疾病的2型糖尿病患者、经活检确诊的糖尿病肾病患者以及非糖尿病肾病患者的尿液三种成分（细胞团、无细胞RNA以及尿外泌体）中检测了这些长链非编码RNA的表达情况。在发现组中，MALAT1的表达水平存在明显差异，其在尿液细胞团中的表达最为强烈（ΔCt值小于8.3时即可高灵敏度地识别糖尿病肾病，灵敏度为90%，特异性为89.6%，比值比为53.9）。为了确认MALAT1确实源自肾脏，研究人员还在活检组织中检测了它的表达情况。在独立验证组中，这些研究结果得到了进一步验证，MALAT1显示出良好的灵敏度（88.5%）和特异性（90%）。将MALAT1纳入现有的诊断算法中（该算法已包含现有的临床及实验室检测指标），可显著提升诊断的准确性，其校正净收益值为0.53，这说明MALAT1相比现有的标志物具有更高的区分价值，有助于区分糖尿病肾病与非糖尿病肾病。