《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Advances in organoid imaging and automated morphometric analysis: from optical microscopy to computational approaches
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全球研究人员越来越关注通过培养球状体（spheroids）和类器官（organoids）来再现器官发生的方法。与球状体不同，类器官在结构和功能活性上与器官更为接近。由于类器官生产方案的多样性以及缺乏精确的形态标准来标准化这些方法，因此越来越需要将形态特征识别为
全球研究人员越来越关注通过培养球状体（spheroids）和类器官（organoids）来再现器官发生的方法。与球状体不同，类器官在结构和功能活性上与器官更为接近。由于类器官生产方案的多样性以及缺乏精确的形态标准来标准化这些方法，因此越来越需要将形态特征识别为成熟且功能健康的类器官的重要区分指标。为了解决这些问题，已开发出各种半自动和自动程序。本综述考察了用于球状体和类器官形态测量分析的程序。这些程序大多利用明场显微镜（brightfield microscope）和共聚焦激光显微镜（confocal laser microscope）拍摄的图像。
2 类器官和集合体（assembloids）生产方法的特征
最早（2001年）关于从人类多能干细胞分化出神经元的报道涉及胚状体形成神经玫瑰花结，而首个（2013年）关于从人类多能干细胞生产脑类器官的工作由Lancaster等人完成，他们利用旋转生物反应器在基质胶（Matrigel）中刺激胚状体向神经外胚层分化。此后，多种协议被开发出来，可生产具有特定脑区域特征的脑类器官（如海马、小脑、中脑、垂体、丘脑和大脑皮层）。悬浮培养法通过低吸附U形板、微阵列和悬滴法实现标准化，生物反应器和轨道振荡器用于搅拌阶段。使用生物工程聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）微纤维创建漂浮支架，模拟皮质基底膜，促进神经外胚层分化和皮质组织细胞结构的正确形成。实验室生产的三维脑类器官已成为经典动物和体外模型的替代品，用于患者特异性建模多种神经疾病（如阿尔茨海默病、帕金森病、小头畸形、精神分裂症、自闭症谱系障碍）。脑类器官的细胞组成与人类脑组织一致，包含神经元、胶质细胞和小胶质细胞，并显示中间祖细胞和不同分化阶段的神经元。然而，由于缺乏发达的血管系统，类器官中心区域会坏死，长期培养（2个月）后仅相当于宫内脑发育水平。为促进成熟和细胞间相互作用，研究人员开发了集合体（assembloids），通过整合多个类器官（多区域结构）或与额外细胞类型融合而成。例如，融合内侧神经节隆起和皮层特异性类器官可观察中间神经元迁移。血管化方法包括在类器官内诱导血管内皮细胞分化（VEGF诱导）、与人类脐静脉内皮细胞（HUVEC）共培养、融合分别生长的神经和血管类器官，以及使用微流控芯片技术。
3 类器官成像的重要性
类器官作为有前景的组织工程工具，需要合适的成像方法和准确的定量形态测量分析。这些方法能够客观评估关键参数，如生长、分化、对外部刺激（如药物）的反应以及病理变化的发展。成像技术不仅支持对类器官形态的观察，还为后续定量分析提供基础数据，确保研究结果的可靠性和可重复性。
4 类器官形态分析的重要性
形态是成熟、功能健康类器官的关键指标之一，可用于评估类器官质量。例如，早期形态变化和出芽结构的形成是成功脑类器官分化的关键标志。形态测量分析不仅用于细胞计数和类型鉴定，还用于研究目的，如评估细胞迁移、组织通透性、坏死表现以及比较不同组别类器官的形态特征。该分析有助于从主观视觉评估转向客观定量分析，提高研究的可重复性和统计学意义。
5 球状体和类器官成像方法
5.1 培养活力评估
用于分析球状体细胞的方法可分为两类：分析培养基中细胞死亡标志物或溶解有色化合物（如乳酸脱氢酶（LDH）测试、刃天青测试、荧光蛋白泄漏评估）；以及分析整个球状体染色性质（如MTT或WST8测试原位染色强度评估、钙黄绿素AM/碘化丙啶荧光染色、总生物发光测量）。激光辐射实验显示，球状体大小变化可作为细胞活力的间接指标。
5.2 类器官成像预处理
5.2.1 作为全标本研究准备
光学透明化方法用于研究三维全标本，通过降低光散射，使各种细胞组分的折射率一致。使用有机溶剂、高折射率水溶液、组织超水化和转化溶液等透明化协议，可在保持类器官生理功能和活力的同时实现透明化（如等渗透明介质SeeDB-Live）。
5.2.2 类器官切片制备
显微镜检查三维脑结构需预先固定（多聚甲醛）并切割成5–50微米厚切片，以便观察脑类器官和球状体。
5.3 研究脑类器官的显微镜方法
大多数研究人员使用明场显微镜、光片显微镜和共聚焦显微镜来满足脑类器官分析的不同需求。明场显微镜保留标本原始颜色，但三维成像能力有限；共聚焦显微镜允许在三维空间中研究类器官，但需使用荧光标记；光片显微镜通过侧向照明形成光片，便于三维重构，但设备昂贵且样品制备要求高。
5.3.1 共聚焦激光显微镜
共聚焦显微镜比明场显微镜更常用于类器官可视化，可研究三维空间结构，但需荧光标记。该方法无需切片即可获取图像（如培养厚度达100微米的类器官）。三维可视化可有效获取形状信息并量化三维细胞结构，例如使用AMIDA程序处理共聚焦图像，识别抑制转移的药物。
5.3.2 明场显微镜
明场显微镜使用Incucyte? S3类器官模块、免疫组织化学染色和免疫荧光比较上皮卵巢癌球状体和类器官的形态，发现类器官形态异质性高、生长动力学和增殖活性不同。水凝胶培养的类器官在明场下难以对焦，产生不均匀模糊。OrganoSeg自动系统可处理此类图像。明场显微镜无需特殊预处理即可观察类器官发育各阶段，是更通用的工具。
6 球状体、类器官图像分割和形态测量分析方法评估及细胞分析额外工具
6.1 OrganoSeg
OrganoSeg是基于明场显微镜的自动类器官形态测量软件，提供易于使用的界面，提取23个形态和纹理参数（如面积、直径、方向、离心率等），利用tSNE进行表型分类。它可处理数千个类器官，但需参数优化，对聚焦不良的类器官吞吐量低，准确性依赖图像质量，且需要人工复核。新版本OrganoSeg2（2026年）处理速度提升十倍，引入新分割设置，但仍需手动纠错重叠球状体。
6.2 肠道类器官在硅（in silico）和体外（in vitro）形态测量分析
该方法结合数学模型与实验数据，评估肠道类器官发育和形态变化，如隐窝形成深度。结合隐窝计数算法和基于代理的模型模拟生物力学相互作用，预测隐窝结构。支持在硅实验，减少体外实验需求。局限是准确性依赖分割质量，且目前多基于二维投影，限制对复杂三维结构的全面研究。深度学习算法（如Deliod）已被集成到管道中，用于确定类器官类别和发育阶段。
6.3 自动形态测量图像数据分析（AMIDA）
AMIDA自动分析包含数千个多细胞结构的大数据集，测量面积、圆度、粗糙度、密度等19个参数，评估动态形态变化（如侵袭模式、上皮-间质转化）。优化用于基质培养，但需校准分割算法和分析参数，准确性依赖显微镜质量，且对计算能力要求高。
6.4 MOrgAna
MOrgAna为非专家提供友好界面，为高级用户提供模块化Python代码，使用深度学习进行像素分类，优于OrganoSeg和CellProfiler，能够区分背景、类器官及其边界。但需手动图像注释训练，最佳适用于单类器官图像，并需GPU高计算能力。
6.5 额外工具和平台
BrAIn（脑类器官AI平台）：
利用深度学习进行高通量形态分析，量化面积、费雷特直径、周长、圆度等参数，识别细微表型并预测功能结果。
OrganoLabeler：
基于深度学习的工具，用于快速准确标注类器官图像，简化形态、生长和分化分析，减少手动标注劳动。
OrganoID：
基于AI的平台，自动跟踪和量化单个类器官随时间的变化，监测面积、周长、圆度等参数。
LabelFreeTracker：
无荧光成像方法，使用三维明场成像和卷积神经网络（3D U-net）预测细胞和核边界，提取细胞数量和体积。
Ilastik：
交互式开源软件，使用机器学习进行分割、分类、计数和跟踪，支持图像至五维（3D+时间+通道），无需编程，但需图像标注和时间。
CellProfiler：
开源软件，通过“管道”定制分析任务，包含50多个模块用于照明校正、分割和参数测量（大小、形状、强度），可处理数十万图像。
Fiji（ImageJ发行版）：
集成软件库和多种脚本语言，支持快速原型开发，基于平台促进计算机科学与生物学合作。
AnaSP：
开源软件，基于明场图像自动估计球状体形态参数，如短轴、长轴、等效直径、周长、面积、体积和球度。
OrganoidTracker：
半自动工具，使用机器学习（3D U-net）和手动误差校正跟踪类器官中细胞，自动标记可疑事件，用户仅需校正约1–2%数据。
TrackMate：
Fiji/ImageJ插件，支持自动、半自动和手动跟踪二维、三维和四维图像中的单个粒子，可扩展添加专用模块。
SpheroidAnalyseR：
基于网络的平台，自动化分析96孔板中球状体或类器官数据，测量面积、直径、圆度，无需编程经验。
6.6 形态测量工具的比较优势和局限
通过分析各工具测量参数（表1），常见监测类器官生长的参数包括面积、周长和直径，这些参数可通过长期每日视觉监测定性评估，因此将其转换为定量评估的重要性增加。例如，研究人员测量并比较类器官直径作为生长指标，同时测量圆度、密度和纵横比以表征形状。开发类器官质量标准的非侵入性五点评分方法可筛选低质量类器官。形态测量方法比功能测试（如细胞外记录、钙成像、单细胞RNA测序）更非侵入且易用，可用于长期监测。
6.7 细胞结构分析额外工具
Yakovlev等提出基于机器学习的方法，识别和分析相差显微镜下未标记星形胶质细胞的形态，提取细胞面积、核大小、分支长度和节点数。BCSnet是基于U-Net架构的深度学习模型，用于台盼蓝染色图像中脑细胞的自动分割，评估细胞活力，最佳模型索伦-戴斯指数达0.9189，活神经元评估速度比手动快三个数量级。
7 球状体和类器官形态测量方法的现代趋势和前景
当前趋势包括：人工智能和机器学习的发展，创建更复杂的神经网络处理异质性、识别细微表型；多变量数据集成，将形态测量数据与转录组学、蛋白质组学等结合，揭示形态与分子机制的联系；高通量四维分析，结合高速成像与低光毒性，开发自动细胞跟踪工具；标准化和可及性，推广开源软件和标准化协议，提高可重复性；创建“数字孪生”结合实验数据与数学模型，预测行为和药物反应。未来将整合多种成像技术和计算工具，构建综合分析平台，克服现有技术障碍，加速科学发现向临床转化。
8 结论
球状体和类器官形态测量领域发展迅速，从简单二维培养转向复杂三维结构需新可视化与定量分析方法。可视化方法如共聚焦和光片显微镜不断发展；软件工具如OrganoSeg、AMIDA、MOrgAna等实现自动化和规模化，深度学习平台如BrAIn、OrganoLabeler显著提高分割精度。通用工具（ilastik、CellProfiler）和专用插件（TrackMate）提升灵活性与可及性。该领域正处于重大突破前夜，将更准确地利用这些独特生物模型进行基础发现和医学转化应用。
