推拿(Tuina)疗法通过调节CX3CL1/CX3CR1轴抑制神经元周围网(perineuronal nets, PNNs)降解缓解神经病理性疼痛

《Frontiers in Molecular Neuroscience》：Tuina therapy alleviates neuropathic pain by modulating the CX3CL1/CX3CR1 axis to inhibit degradation of the perineuronal nets

　　

摘要：引言：推拿(Tuina)是一种传统中医非药物疗法，对神经病理性疼痛(neuropathic pain, NP)具有确切疗效，但其潜在分子机制尚不清楚。CX3CL1/CX3CR1轴介导的神经元周围网(perineuronal nets, PNNs)降解是中枢敏化的重要驱动因素。本研究探讨推拿是否通过调节该神经-免疫轴以保护PNNs完整性，在背根神经节慢性压迫(chronic compression of the dorsal root ganglion, CCD)大鼠模型中发挥镇痛作用。方法：采用CCD手术建立NP大鼠模型。为验证PNNs的作用，部分大鼠鞘内注射硫酸软骨素酶ABC(chondroitinase ABC, chABC)。为探究推拿机制，将大鼠分为假手术组(Sham)、模型组(Model)、推拿组(Tuina)、CX3CR1抑制剂(AZD8797)组及推拿+AZD8797组(Tuina+AZD8797)。术后第4～14天给予标准化推拿干预或抑制剂处理。评估疼痛行为学（机械性缩足阈值Paw Withdrawal Threshold, PWT及热缩足潜伏期Paw Withdrawal Latency, PWL），取脊髓背角组织行透射电镜、Western blotting、免疫荧光及流式细胞术检测。结果：CCD诱导严重的机械性异常性疼痛和热痛觉过敏，伴脊髓PNNs结构破坏——表现为WFA结合糖胺聚糖(glycosaminoglycan, GAG)链显著丢失而聚集蛋白聚糖(aggrecan)核心蛋白水平不变——及神经元超微结构损伤。机制上，CCD上调CX3CL1/CX3CR1/PI3K/AKT级联，伴随小胶质细胞吞噬标志物（TREM2和LAMP1上调）、Ca2+内流及c-FOS蓄积。推拿干预减轻上述病理改变，显著恢复WFA表达，提示PNNs结构完整性得以保留。联合治疗（推拿+AZD8797）较单药产生更强的镇痛及生化指标恢复效应。结论：推拿通过抑制CX3CL1/CX3CR1–PI3K/AKT信号通路产生强效中枢镇痛作用，该抑制作用恢复小胶质细胞吞噬稳态，并关键性地保护PNNs的糖胺聚糖网络免受过度降解，从而缓解神经病理性中枢敏化。

论文解读：《Frontiers in Molecular Neuroscience》发表研究——推拿通过调节CX3CL1/CX3CR1轴抑制神经元周围网降解缓解神经病理性疼痛

一、研究背景与立项依据

神经病理性疼痛（neuropathic pain, NP）由糖尿病周围神经病变、创伤性神经病变、椎间盘突出等多种病因引起，临床表现为自发痛、痛觉过敏及异常性疼痛，常伴睡眠障碍、抑郁和焦虑，成人患病率约7%～10%，是慢性疼痛的重要亚型。中枢敏化（central sensitization, CS）是慢性疼痛异常伤害性信息传递的核心机制，指脊髓及脊髓上通路神经元兴奋性增高状态，脊髓背角（spinal dorsal horn, SDH）尤Lamina I区是伤害性信息传递的关键枢纽。近年研究发现，SDH内一类被神经元周围网（perineuronal nets, PNNs——富含硫酸软骨素糖胺聚糖chains attached to aggrecan core protein的特殊细胞外基质）包裹的脊髓-臂旁束投射神经元参与痛觉编码。周围神经损伤后，驻留的小胶质细胞（microglia，中枢神经系统固有免疫哨兵）介导PNNs的吞噬性侵蚀，使其结构降解，解除对投射神经元的抑制性"刹车"，导致神经元过度兴奋和伤害性传递放大。该过程受趋化因子Fractalkine（CX3CL1）/其受体CX3CR1信号轴调控——CX3CL1/CX3CR1激活驱动神经炎症、促炎因子释放及Ca²⁺内流，促进疼痛 hypersensitivity。推拿（Tuina）作为传统中医非药物疗法，临床证实可改善多种疼痛，前期研究表明其可促使小胶质细胞由M1向M2表型偏移并下调IL-6、IL-1β、TNF-α等炎性因子，但尚无直接证据证明推拿是否通过调节CX3CL1/CX3CR1轴影响小胶质细胞吞噬活性进而干预PNNs降解。因此，研究人员建立CCD诱导的NP大鼠模型，给予11天推拿干预，旨在阐明推拿是否经CX3CL1/CX3CR1–小胶质细胞–PNNs信号轴调节脊髓中枢敏化并缓解疼痛。

二、主要关键技术方法概述

研究人员采用两批次实验：实验1设Sham、CCD模型(Model)、鞘内注射chondroitinase ABC(chABC)组（n=12/组），验证PNNs降解在痛觉敏化中的作用；实验2设Sham、Model、Tuina、CX3CR1抑制剂AZD8797组及Tuina+AZD8797(TA)组（n=12/组），探究推拿机制。CCD模型通过L4–L5椎间孔插入L形不锈钢棒压迫背根神经节建立。推拿组于术后第4天起连续11天在患侧委门(BL37)、委中(BL40)、承山(BL57)穴行拇指按揉法（5 N，2 Hz，每穴5 min）。AZD8797组腹腔注射80 μg/kg/日；TA组联合干预且间隔＞2 h。行为学检测PWT（电子Von Frey）和PWL（热板50℃），分别于术前及术后第4、7、10、14天测定。终末取同侧脊髓背角，行透射电子显微镜（TEM）观察超微结构；免疫荧光检测WFA（PNNs GAG链）、aggrecan（核心蛋白）、c-FOS（神经元活化标志）；Western blotting检测CX3CL1、CX3CR1、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、TREM2、LAMP1；流式细胞术（Fluo-4 AM探针）检测细胞内Ca²⁺水平。所有定量由盲法评估，统计分析采用单因素ANOVA或Kruskal-Wallis H检验。

三、研究结果

3.1 Degradation of PNNs in the spinal dorsal horn is sufficient to induce mechanical and thermal hyperalgesia

研究人员发现Sham组PWT和PWL稳定，CCD模型组术后第4、7、10、14天PWT和PWL较Sham显著降低（p＜0.001）；单独鞘内注射chABC降解PNNs的组别同样出现与CCD模型高度一致的PWT和PWL下降。表明PNNs降解本身足以诱发机械性及热痛觉敏化，是疼痛敏化的关键致病环节。

3.2 chABC specifically cleaves the glycosaminoglycan chains of spinal PNNs

免疫荧光显示Model组和chABC组脊髓背角WFA（标记GAG侧链）平均荧光强度较Sham显著降低（p＜0.05），而aggrecan核心蛋白荧光强度各组间无差异（p＞0.05），共定位分析一致。说明CCD病理状态和chABC均主要通过选择性剪切PNNs的糖胺聚糖链破坏其网络屏障功能，而非降解核心蛋白。

3.3 PNNs degradation triggers intracellular calcium dyshomeostasis and neuronal ultrastructural damage

Model组和chABC组脊髓背角c-FOS表达较Sham大幅上调（p＜0.0001），高 intracellular Ca²⁺细胞比例显著升高（p＜0.05）；TEM显示Model组和chABC组神经元出现核固缩染色质凝聚、线粒体肿胀空泡化（嵴消失、外膜破裂）及粗面内质网轻度扩张，Sham组超微结构完好。提示PNNs降解直接导致神经元钙超载和超微结构损伤，引发异常兴奋。

3.4 Tuina alleviates CCD-induced hyperalgesia and ameliorates neuronal ultrastructural damage

CCD模型组PWT和PWL较Sham骤降（p＜0.01），推拿干预使其在第7、10、14天显著回升（p＜0.01）；AZD8797单药镇痛效果与推拿相当（组间p＞0.05），而Tuina+AZD8797联合产生叠加效应，痛阈进一步升高（p＜0.01）。TEM显示推拿和AZD8797均减轻神经元核固缩及线粒体、内质网损伤，联合组超微结构保存最完整。说明推拿可有效逆转CCD诱导的痛觉过敏及神经元损伤，且其作用与抑制CX3CR1相关。

3.5 Tuina preserves PNNs integrity and restores neuronal homeostasis by inhibiting excessive phagocytosis

Western blot示Model组TREM2和LAMP1（小胶质细胞吞噬/溶酶体关联标志）上调，推拿显著下调二者表达（p＜0.05）；免疫荧光示Model组WFA降低，推拿或AZD8797均恢复WFA水平（p＜0.05），联合干预WFA恢复更显著（p＜0.05）。c-FOS过表达被推拿抑制（p＜0.05），高Ca²⁺细胞比例下降（p＜0.05）。表明推拿抑制小胶质细胞过度吞噬及溶酶体降解活性，减少PNNs GAG链丢失，从而维持神经元兴奋稳态。

3.6 Tuina exerts analgesia by inhibiting the upstream fractalkine/CX3CR1 and PI3K/AKT signaling pathways

CCD建模后脊髓背角CX3CL1、CX3CR1蛋白及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比值显著升高（p＜0.05），总PI3K和AKT无变化；推拿显著抑制CX3CL1、CX3CR1异常表达及p-PI3K、p-AKT水平（p＜0.05），效应与AZD8797相似。提示推拿对CCD大鼠痛觉过敏的改善是通过负调控CX3CL1/CX3CR1信号轴及其下游PI3K/AKT磷酸化级联实现的。

四、讨论与结论总结

讨论部分指出，本研究首次在CCD NP模型中证实推拿通过抑制CX3CR1介导的PI3K/AKT级联，降低小胶质细胞过度吞噬（TREM2↓、LAMP1↓），保护PNNs糖胺聚糖网络完整性，从而减弱脊髓背角中枢敏化。CX3CL1/CX3CR1轴是推拿中枢镇痛的关键通路，与既往该轴在脊髓水平抑制疼痛敏化的研究相符。PNNs动态平衡是慢性痛治疗的新靶点，本研究从神经-免疫互作角度提供了推拿保护PNNs的直接生化与超微结构证据。作者亦说明局限性：CCD大鼠模型与人临床疼痛存在差异；未涉及脑干下行抑制通路及PI3K/AKT下游精细网络；小胶质细胞吞噬PNNs物质为间接推论，未来需用CX3CR1-Cre谱系追踪或微胶质细胞特异性敲除及高分辨率成像确证。

结论（翻译）：本研究表明CX3CL1/CX3CR1信号轴在CCD后介导脊髓背角小胶质细胞依赖性PNNs降解中起关键作用。推拿干预通过抑制CX3CR1介导的PI3K/AKT级联，抑制小胶质细胞过度吞噬（TREM2和LAMP1下调）并保护PNNs结构完整性，从而减轻中枢敏化，发挥神经病理性疼痛的缓解作用。该发现揭示了推拿镇痛的一种新型神经-免疫机制，并为慢性神经病理性疼痛的临床非药物管理提供了潜在靶点。