体外扩增自体调节性T细胞治疗肌萎缩侧索硬化症的开发及疗效研究

《Frontiers in Immunology》：Development and efficacy of ex vivo expanded autologous regulatory T cells for the treatment of amyotrophic lateral sclerosis

　　

肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS）是一种治疗手段有限的致命性神经退退行性疾病，其中神经炎症是疾病进展的关键驱动因素。调节性T细胞（Regulatory T cells, Tregs）具有强效免疫抑制及神经保护作用，在ALS治疗中具较大潜力。然而外周血中Treg细胞丰度低及扩增质量不稳定阻碍了Treg疗法的临床应用。本研究建立并优化了一套GMP（Good Manufacturing Practice）级方案，用于分选及体外扩增外周血来源的Tregs，并验证冻存单采产品（apheresis products）可作为可行的起始原料。尽管ALS患者来源的Tregs较健康供者Tregs体外扩增能力下降，但其维持了相当的纯度、稳定的调节性表型及强效免疫抑制功能。转录组学分析证实扩增后Tregs维持谱系保真性（lineage fidelity）且低表达促炎特征基因。治疗效能在SOD1G93AALS小鼠模型及移植物抗宿主病（Graft-versus-Host Disease, GvHD）小鼠模型中得到验证，表现为延迟疾病进展及减轻炎症反应。本研究提供了标准化的GMP制备策略及坚实的临床前证据，以支持正在开展的临床试验（NCT06671236）并推动Treg免疫治疗在ALS中的转化应用。

本文解读基于发表于《Frontiers in Immunology》的论文《Development and efficacy of ex vivo expanded autologous regulatory T cells for the treatment of amyotrophic lateral sclerosis》。

研究背景：肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS）是一种进行性致死性神经退行性疾病，主要累及大脑皮层、脑干和脊髓的上、下运动神经元，患者通常在确诊后3～5年内死亡。目前FDA批准的药物利鲁唑（Riluzole）、依达拉奉（Edaravone）及Tofersen（Tofersen）仅能轻微延长生存期或延缓症状，远未满足临床需求。慢性神经炎症是ALS核心病理机制之一，表现为中枢神经小胶质细胞活化、星形胶质细胞增生及外周T细胞浸润。调节性T细胞（Regulatory T cells, Tregs；CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺）通过抑制促炎细胞、促进巨噬细胞/小胶质细胞向抗炎表型转化、上调神经营养因子发挥神经保护作用。既往研究表明ALS患者外周血及脑脊液中Treg频率与疾病进展速率负相关，动物模型中恢复Treg功能可减轻神经炎症并延长生存期。外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）中天然存在的Tregs是最具临床可及性的细胞来源，自体回输可避免移植物抗宿主病（Graft-versus-Host Disease, GvHD）及宿主抗移植物反应。但Tregs在外周血中仅占CD4⁺T细胞的5%～10%，直接分选所得细胞数量远低于临床需求，且ALS患者来源Tregs扩增能力可能受损，加之缺乏标准化GMP（Good Manufacturing Practice）制备工艺，限制了其临床转化。因此，本研究旨在建立并优化GMP级Treg分选及体外扩增工艺，验证冻存单采产品（Leukapheresis, APH）作为起始材料的可行性，比较ALS患者与健康供者（Healthy Donor, HD）来源Tregs在质量与功能上的差异，并通过转录组学及动物模型验证其安全性、谱系稳定性及治疗效能，为开展ALS自体Treg细胞治疗临床试验提供临床前依据。

主要关键技术方法：研究人员采集健康供者及ALS患者外周血单采产品（APH），部分单采产品经液氮冻存后复苏使用；比较三种Treg分选方法——流式细胞术分选（FACS，Protocol A）、CD8^-CD19^-负选择联合CD25⁺磁珠富集（Protocol B）及商品化CD4⁺CD25⁺调节性T细胞分选试剂盒（Protocol C），最终选定Protocol B进行GMP生产；体外扩增采用OpTmizer?培养基联合CD3/CD28 Treg Xpander激活剂、添加雷帕霉素（Rapamycin）及人血小板裂解物替代品EliteGro-Adv；终产品检测包括流式细胞术鉴定CD4⁺CD25⁺CD127^lowFoxP3⁺表型、体外抑制Teff（Effector T cells）增殖及IFN-γ分泌功能、台盼蓝/荧光染色检测活率、无菌/内毒素/支原体检测；转录组学对扩增Tregs、扩增PBMCs、未扩增Tregs及未扩增PBMCs进行mRNA测序分析；体内药效学分别采用人PBMC诱导的C-NKG小鼠GVHD模型（静脉给予人源Tregs）及B6-hSOD1^G93A转基因ALS小鼠模型（鞘内注射小鼠源Tregs）评估生存、体重、临床评分及运动功能。

研究结果：

3.1 Development and optimization of CMC processes

研究人员比较三种分选方案发现FACS纯度最高（CD4⁺CD25⁺CD127^?约96.5%）但得率低且难满足GMP要求，试剂盒非GMP级，磁珠法（Protocol B）得率最高（1.17%±0.21%）、扩增倍数最优（D20约443倍）且适合封闭系统GMP生产，故选为正式工艺。体外扩增条件筛选确定OpTmizer培养基联合Treg Xpander激活剂、添加100 nM雷帕霉素及5% EliteGro血清替代物可在保持高FoxP3⁺比例（D22约86.89%）的同时获得良好扩增（平均约137倍），优于X-VIVO15及无雷帕霉素组；EliteGro较人血小板裂解物（Human Platelet Lysate, HPL）扩增效率更高（D22约1323倍 vs 718倍）且纯度无差异。冻存复苏终产品在15个月内各质控指标均符合放行标准。

3.2 Feasibility verification of APH after cryopreservation as raw material for production

研究人员对比新鲜与冻存复苏健康供者APH来源Tregs，结果显示分选后活率（冻存组88.13%±3.49% vs 新鲜组96.25%±0.98%）、回收率、CD4⁺CD25⁺CD127^?FoxP3⁺比例、体外扩增倍数、活率变化曲线及终产品抑制功能（冻存组65.98%±2.4% vs 新鲜组69.54%±4.28%@Treg:PBMC=1:1）均无显著差异，表明冻存APH是可行的起始原材料。

3.3 GMP manufacturing: ALS patients vs health donors

研究人员在GMP条件下分别由7例ALS患者及4例健康供者APH制备Tregs。分选阶段细胞回收率（ALS 1.13%±0.21% vs HD 1.23%±0.17%）及活率（均>86%）无差异；培养阶段活率均恢复至>95%，但ALS组扩增倍数显著低于健康供者（D20：ALS 69.41±6.70 vs HD 142.99±25.26，p<0.05）；终产品CD4⁺CD25⁺CD127^?（ALS 93.94%±0.83% vs HD 96.61%±0.80%）及CD4⁺CD25⁺CD127^?FoxP3⁺（ALS 82.20%±2.70% vs HD 84.67%±2.45%）比例无显著差异；体外抑制Teff增殖（ALS组1:1比例下88.92%±3.75% vs HD组相当）及抑制IFN-γ分泌功能（ALS 78.41%±5.95% vs HD 87.51%±5.51%）亦无显著差异。相关性分析显示ALS功能评分（ALSFRS-R）与起始APH中及分选后早期（D8–D12）Treg比例、体外扩增中Treg比例呈正相关，与终产品抑制功能呈整体负相关趋势，但与抑制IFN-γ分泌呈中等正相关。

3.4 Phenotypic analysis of Treg products from cryopreserved healthy donors, fresh healthy donors, and ALS patients

研究人员分析功能分子表达发现ALS患者来源Tregs PD-L1表达显著高于新鲜健康供者来源Tregs（p<0.05），CD39略降但无统计学差异；耗竭/检查点分子LAG3⁺、TIM3⁺在ALS组显著高于健康供者（p<0.05），且主要在体外扩增阶段上调而非分选时即存在差异；记忆亚群中ALS组中央记忆T细胞（T_CM，CD45RO⁺CCR7⁺）比例略高、效应记忆T细胞（T_EM，CD45RO⁺CCR7^?）略低但无显著差异；趋化因子受体分析显示Th1样Treg（CXCR3⁺CCR6^?）占比最高。

3.5 mRNA sequencing reveals different transcription profiles of expanded Treg cells

研究人员通过mRNA测序发现扩增Tregs转录谱与未扩增Tregs聚为一类且与扩增PBMCs明显分开，证实体外扩增维持Treg谱系保真性。扩增Tregs高表达FoxP3、CTLA4、GARP（LRRC32）、IL-10、MAF等抑制/稳态相关基因，低表达促炎因子（IFN-γ、IL-17、IL-9、IL-13、GZMB、CSF2）及促炎趋化因子（CCL3/CCL4、XCL1/XCL2、CXCL9/CXCL10），仅CCL17/CCL22轻度表达。Helios在扩增后表达较未扩增Tregs降低，提示天然Tregs中外周诱导Treg（peripheral Tregs, pTregs）更易扩增。结果表明该扩增工艺不仅维持而且增强了Tregs的抑制性转录表型。

3.6 Animal pharmacodynamics / 3.7 Validation in SOD-1 mutant ALS animal model

研究人员在B6-hSOD1^G93A小鼠模型中发现，鞘内注射小鼠源Tregs显著延迟疾病发病（p=0.0004），延长无事件生存（Event-Free Survival, EFS，p=0.0304），有延长总生存趋势（p=0.1113不显著），给药期（D0–D28）体重丢失有延迟趋势，Kono评分恶化延迟（D55 p=0.011），旋转棒滞留时间及后肢握力有改善趋势但未达统计学意义。

3.8 Validation in animal GvHD model

研究人员在huPBMC重建C-NKG GvHD模型中发现，静脉给予人源Tregs显著提高小鼠生存率（p<0.05），显著改善体重丢失（D38 p<0.05）及降低GvHD临床严重程度评分（D41–D48 p<0.05或p<0.01）。

讨论与结论：本研究建立了基于CliniMACS系统的GMP级CD8^?CD19^?负选择联合CD25⁺正富集的Treg分选及OpTmizer+雷帕霉素+EliteGro+CD3/CD28 Treg Xpander体外扩增工艺；证实冻存复苏APH可作为合格起始物料；ALS患者来源Tregs虽扩增倍数约为健康供者一半，但终产品纯度、FoxP3表达及体外免疫抑制功能与健康供者无显著差异，且转录组证实扩增后Tregs维持谱系特异性和低促炎特征；SOD1^G93AALS小鼠及人PBMC-GvHD小鼠模型证实其延缓疾病进展、减轻炎症的体内药效。局限性在于ALS晚期重症患者可能因外周血采集量不足无法满足工艺起始细胞数要求，且个体间Treg状态差异存在理论扩增失败风险（当前约20例临床回输未见失败但需更大样本验证）。该研究为开展注册临床试验（NCT06671236）提供了标准化CMC（Chemistry, Manufacturing and Controls）工艺参数及临床前有效性、安全性依据，支持自体Treg细胞免疫治疗向ALS临床转化。