《BMC Plant Biology》：Seed priming versus foliar spraying of biologically synthesized mixed-valence copper oxide(Cu4O3): improving sunflower growth under salt stress
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气候变化是全球性重大挑战，土壤盐渍化已成为限制农业生产力的关键因素。本研究报道了利用银合欢（Leucaena leucocephala）种子提取物和硫酸铜为前驱体生物合成混价氧化亚铜（Cu?O?）纳米粒子（mixed-valence copper oxide
气候变化是全球性重大挑战，土壤盐渍化已成为限制农业生产力的关键因素。本研究报道了利用银合欢（Leucaena leucocephala）种子提取物和硫酸铜为前驱体生物合成混价氧化亚铜（Cu?O?）纳米粒子（mixed-valence copper oxide nanoparticles, MVCN），并评估其在缓解向日葵（Helianthus annuus L.）盐胁迫中的作用。合成后的MVCN通过能量色散X射线光谱（energy-dispersive X-ray spectroscopy, EDX）、X射线衍射（X-ray diffraction, XRD）、傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR）、紫外-可见光谱（UV-Vis spectroscopy）、扫描电子显微镜（scanning electron microscope, SEM）、透射电子显微镜（transmission electron microscope, TEM）及Zeta电位进行分析表征。FTIR证实了种子提取物对纳米粒子的有效包封，SEM显示球形颗粒（13–18 nm），TEM则呈现出多样化形貌，提示各向异性生长。在150 mM NaCl胁迫下进行盆栽试验，MVCN通过种子引发或叶面喷施（100 mg/L）两种方式施用。两种处理均能促进植株生长并改善生化性状，其中叶面喷施效果更佳。生长参数显著提升：地上部鲜重（32%）、地上部干重（50%）、株高（56%）、根鲜重（65%）、根干重（35%）及叶面积（30%）。生化指标改善包括：叶绿素a（49%）、可溶性糖（45%）、可溶性蛋白（30%）、含油量（34%）、酚类化合物（31%）及脯氨酸（29%）。相反，Na+含量和丙二醛（malondialdehyde, MDA）水平分别降低34%和46%，表明盐胁迫诱导的损伤得到缓解。这些发现证明，生物合成MVCN的叶面施用是一种可持续且有前景的策略，能够增强作物在盐胁迫下的抗性，有助于提高盐碱环境中的农业生产力。
土壤盐渍化目前影响着全球约五分之一的耕地和近一半的灌溉农田，且受气候变化、不当灌溉管理及海平面上升等因素影响，这一比例预计将进一步攀升。盐胁迫在生理、生化和分子多个层面破坏植物功能，导致生长受抑、营养亏缺及光合速率下降。盐胁迫还会诱导活性氧（reactive oxygen species, ROS）积累，造成膜脂、蛋白质及DNA损伤。向日葵作为全球主要油料作物，其生长高度依赖水分供应，盐胁迫限制水分吸收、扰乱营养平衡并导致ROS积累，最终降低含油量。
近年来，研究人员探索了多种缓解向日葵盐胁迫的策略，包括蔗糖施用、石膏与堆肥联用、生物炭改良剂、枯草芽孢杆菌与生物炭联合应用，以及水杨酸与银纳米粒子 topical施用等。纳米材料因其在低浓度下的高效性而在农业应用中展现出广阔前景，这主要归因于纳米粒子在低浓度下表现出的生物刺激素（biostimulant）特性。生物合成纳米粒子是一种可持续策略，可减少对有毒化学品和能源密集型物理技术的依赖，具有显著的生态优势。此外，生物途径合成的纳米粒子与传统化学和物理方法相比，表现出显著降低的细胞毒性和植物毒性，安全性更高、应用范围更广。
氧化铜纳米粒子因其多功能应用及成本效益、易获取性等优势备受关注。铜作为多价金属，与氧反应可生成三种氧化物相：CuO（黑铜矿，tenorite）、Cu?O（赤铜矿，cuprite）和Cu?O?（副黑铜矿，paramelaconite）。其中，Cu?O?最为罕见，是一种含有Cu(II)和Cu(I)混合价态的亚稳态氧化铜，原子比为1.33。由于Cu?和Cu2?离子难以同时稳定存在，传统化学方法合成Cu?O?颇具挑战。而利用植物等生物资源的绿色合成途径因其环境友好性日益受到青睐，能够提供更安全、更环保的方式形成具有多样形貌、尺寸、组成和理化性质的纳米粒子。
铜基纳米粒子（Cu-NPs）作为新型纳米农业化学品，已显示出调控多种植物胁迫响应信号通路的能力。研究表明，氧化铜纳米粒子通过种子引发或叶面喷施方式，能显著减轻小麦、大麦、番茄和玉米等多种农作物中的盐害效应。铜是植物必需微量营养元素，作为可在Cu?和Cu2?态之间循环的氧化还原活性过渡金属，在细胞色素c氧化酶、超氧化物歧化酶和质体蓝素等多种酶中作为结构元素和催化辅因子，参与光合作用、呼吸作用及酶促抗氧化系统等生理生化过程。在纳米尺度上，铜表现出比传统肥料更优的生物利用度、可控养分释放和精准细胞级递送等优势。
尽管已有研究利用植物提取合成氧化铜纳米粒子，但利用银合欢（L. leucocephala）种子提取物生物合成Cu?O?纳米粒子的研究尚属空白。银合欢种子富含黄酮类和酚类化合物、脂肪酸及多糖等多样化植物化学成分，这些成分形成独特的还原和稳定剂序列，可能增强合成纳米粒子的生物活性。本研究旨在通过生物途径合成铜纳米粒子，评估其在缓解向日葵盐胁迫有害效应方面的潜力，通过分析生理和生化过程的变化来深入理解氧化铜纳米粒子对向日葵生长和胁迫生理的影响机制，为改善盐碱条件下作物抗性提供有价值的见解。
该研究发表于《BMC Plant Biology》。
**研究方法概述：** 研究人员采用绿色生物合成途径制备混价氧化亚铜纳米粒子。以银合欢种子为主要生物材料来源，从埃及El-Beheira地区采集植物，经鉴定后制备种子提取物，并以硫酸铜五水合物（CuSO?·5H?O）为前驱体，通过混合反应合成纳米粒子，后续经分离纯化获得产物。纳米粒子经EDX、XRD、FTIR、UV-Vis、SEM、TEM及Zeta电位等多重理化表征确认。在盆栽试验中，选用埃及农业研究中心提供的Giza 120向日葵品种，设置对照（CK）、种子引发（T1）、叶面喷施（T2）、盐胁迫（150 mM NaCl, T3）、盐胁迫+种子引发（T4）及盐胁迫+叶面喷施（T5）共6个处理组，于埃及Damanhour大学理学院温室条件下培养。研究系统测定了生长参数（地上部和根的鲜重与干重、株高、叶面积）、光合色素（叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素）、渗透调节物质（可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸、甜菜碱）、次生代谢物（酚类化合物）、品质指标（含油量）、离子平衡（Na?、K?含量及K?/Na?比值）及氧化损伤标志物（MDA含量），并通过透射电镜观察叶片超微结构，最后进行相关性分析。
**研究结果：**
**MVCN的表征分析：** 通过FTIR光谱分析，研究人员识别了生物合成MVCN过程中生物活性组分的官能团。UV-Vis光谱在235 nm和475 nm处出现吸收峰，295 nm处有肩峰，其中475 nm处的表面等离子共振峰对应Cu?O?的本征带隙吸收，区别于CuO（300–400 nm）和Cu?O（250–350 nm）的吸收特征，证实了混价氧化物的形成。XRD图谱呈现宽化衍射峰，与标准PDF卡号33-0480吻合，确认为四方晶系副黑铜矿（paramelaconite）结构。EDX分析检测到碳（38.64 wt%）、氧、氮和铜元素，高碳含量源于植物提取物的糖类组成。SEM显示纳米粒子呈球形，平均直径14.91±0.894 nm；TEM则观察到球形、棒状和片状等多种形貌，提示各向异性生长，其中棒状粒子直径10–16 nm，片状粒子28–32 nm，球形粒子约5 nm，粒子间存在明显团聚。Zeta电位为-19.4 mV，表明粒子具有较好的分散稳定性。
**MVCN对盐胁迫下向日葵生长参数和叶绿素含量的影响：** 盐胁迫显著抑制向日葵生长，使地上部鲜重、地上部干重、株高、根鲜重、根干重和叶面积分别降低36%、56%、39%、50%、37%和16%。而叶面喷施MVCN（T5）在盐胁迫下使上述参数分别提升32%、50%、56%、65%、35%和30%，效果优于种子引发处理（T4）。在无盐条件下，MVCN处理也促进了生长。
叶绿素a在盐胁迫下降低37%，叶面喷施MVCN使其提升49%；叶绿素b在T5处理下增加42%。在无盐条件下，MVCN处理亦使叶绿素a和b分别提升32%和16%。盐胁迫下叶片超微结构发生明显改变：叶绿体变形，类囊体膜系统（基粒和基质片层）紊乱。MVCN处理后，叶绿体恢复典型椭圆形态，类囊体膜结构重新有序排列，叶面喷施和种子引发均有效。
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**MVCN对可溶性糖、可溶性蛋白和含油量的影响：** 盐胁迫显著降低可溶性糖和可溶性蛋白含量。T5处理使可溶性糖和可溶性蛋白分别增加45%和30%。盐胁迫使含油量降低30%，而T5处理使其提升34%。在无盐条件下，MVCN处理同样提高了含油量。
**MVCN对脯氨酸、甜菜碱和酚类含量的影响：** 盐胁迫使脯氨酸、甜菜碱和酚类含量分别增加33%、48%和44%。T5处理在此基础上进一步使三者分别增加29%、39%和31%。
**MVCN对Na?、K?、K?/Na?比值和MDA含量的影响：** 盐胁迫导致Na?含量增加82%，K?含量及K?/Na?比值下降。T5处理使Na?含量降低34%，同时提升K?含量和K?/Na?比值。MDA作为脂质过氧化标志物，在盐胁迫下增加195%，而T5处理使其降低46%。
**相关性分析：** 生长参数、叶绿素和蛋白含量之间呈强正相关；酚类化合物、脯氨酸和甜菜碱含量之间也存在强正相关。上述所有指标均与Na?含量和MDA水平呈负相关。
**结果分析与讨论总结：** 研究人员深入分析了生物合成MVCN缓解向日葵盐胁迫的作用机制。盐胁迫通过抑制种子萌发、限制营养生长、干扰生殖过程及降低整体生产力而影响植物生长发育，同时在细胞层面引起超微结构改变、膜损伤、ROS过度积累、光合作用受损及酶活性降低。MVCN的应用有效缓解了这些负面影响，其作用机制涉及多个方面：
在光合作用方面，盐胁迫导致的叶绿素下降归因于叶绿体色素的氧化降解及盐胁迫条件下色素-蛋白复合体的不稳定性。MVCN通过刺激 Rubisco 和 ATPase 等关键酶活性，增强光合效率；同时改善叶片超微结构，使叶绿体恢复正常形态。铜作为光合作用电子传递链和卡尔文循环中碳固定过程相关蛋白的必需辅因子，支持碳水化合物生物合成。
在渗透调节和抗氧化防御方面，MVCN处理增加了可溶性糖、脯氨酸、甜菜碱和酚类等渗透保护物质的积累。可溶性糖通过清除ROS、稳定蛋白质结构、调节细胞氧化还原稳态及提供能量发挥保护作用。脯氨酸通过中和自由基、减少ROS、维持膜蛋白完整性、保持细胞膨压、促进离子稳态（减少Na?和Cl?积累、增强K?吸收）及改善光合性能来缓解盐胁迫。甜菜碱通过清除ROS、调节离子吸收运输及维持细胞渗透平衡发挥作用。酚类化合物则通过维持氧化还原稳态减轻盐胁迫影响。这些渗透保护物质的增加也解释了MDA水平的降低，表明氧化损伤得到缓解。
在离子稳态方面，MVCN通过增强Na?/H?逆向转运蛋白活性促进Na?外排，或增加液泡膜Na?/H?交换体（NHX）表达将Na?区 basure 至液泡，从而减少细胞质Na?积累，维持了较高的K?/Na?比值。
关于施用方式的比较，叶面喷施优于种子引发，原因在于叶面可直接通过气孔和叶片表面裂缝吸收，生物利用度更高；纳米粒子与生物分子的相互作用可激活胁迫响应通路，促进渗透保护物质和抗氧化剂的积累。MVCN的纳米级尺寸（13–18 nm）使其能够通过胞间连丝、内吞作用及转运蛋白穿透细胞屏障，并与细胞内结构相互作用，这一尺寸范围最有利于促进植物生长发育。
该研究还强调了合成方法的创新性：与早期需要高温长时间回流的研究相比，本研究仅需室温混合即可实现纳米粒子合成，反应条件温和、能耗低、成本效益高；且以水为反应介质，避免了有机溶剂的使用，符合绿色化学原则，具有长期生态安全性。
**研究局限性与未来方向：** 该研究的主要局限性在于较高浓度下MVCN可能存在植物毒性效应，以及对其环境归途和潜在风险的认识有限。未来研究应阐明吸收途径、评估在植物组织中的长期稳定性、调查跨营养级迁移及在农业生态系统中的持久性。此外，需将MVCN应用与其他非生物胁迫缓解策略（如生物肥料和植物根际促生长细菌）相结合，并采用基因组学和转录组学等先进分子技术深入解析MVCN调控胁迫耐受性的机制。
**实际应用与规模化：** 生物合成MVCN在缓解盐胁迫方面的前景需要在大田条件下进一步验证。叶面喷施与现有农业实践兼容性较好。尽管使用银合欢种子提取物的生物合成方法成本效益高、环境友好，但大规模生产需评估原材料可得性、提取效率和纳米粒子产量。剂量优化、施用频率和递送方式的改进对规模化至关重要，同时需进行长期环境安全评估，并协调研究者、农学家、政策制定者和产业利益相关者以确保功效与合规性。
**结论：** 该研究建立了一种简单、环保且经济高效的可持续合成策略，利用银合欢种子提取物作为天然还原剂、稳定剂和包封剂合成混价氧化亚铜（Cu?O?）纳米粒子。EDX、XRD、FTIR、UV-Vis、SEM、TEM及Zeta电位分析表征均证实了Cu?O?纳米粒子的成功合成。FTIR分析验证了种子提取物的有效包封，SEM显示球形颗粒（13–18 nm），TEM呈现多样化形貌提示各向异性生长。生物合成的MVCN，特别是以叶面喷施方式（100 mg/L）施用，显著增强了向日葵生长并改善了关键生化性状，同时减少了钠积累并降低了氧化损伤。这些结果展示了MVCN作为基于纳米技术的可持续策略在提高盐渍条件下作物抗性和生产力方面的潜力，对应对气候变化背景下的农业挑战具有积极意义。
