由半胱天冬酶介导的非经典坏死途径

《Cell Communication and Signaling》：A non-classical necroptosis pathway mediated by caspases

　　

摘要

背景

坏死性凋亡是一种由RIPK1/RIPK3?MLKL途径调控的细胞死亡形式。在人类中，caspase（CASP）8通过使RIPK1和RIPK3失活来负向调节坏死性凋亡途径。而在硬骨鱼及其他非哺乳类脊椎动物中，caspase在坏死性凋亡中的作用仍有待研究。本研究以大黄鳝Larimichthys crocea作为代表性硬骨鱼物种，探讨了caspase对硬骨鱼坏死性凋亡的调控作用。

方法

通过显微镜观察和生化检测研究坏死性凋亡现象。利用免疫印迹技术分析caspase的切割作用，通过共免疫沉淀法研究蛋白质间的相互作用，再通过序列比对和WebLogo分析评估进化保守性。

结果

从L. crocea中鉴定出三种核心的坏死性凋亡机制组分（RIPK1、RIPK3和MLKL），并分别命名为LcRIPK1、LcRIPK3和LcMLKL。细胞转染实验表明，LcRIPK3会与LcRIPK1结合并招募LcMLKL，随后LcRIPK3激活被招募的LcMLKL。LcMLKL拥有两个对激活至关重要的保守磷酸化位点，模拟这些位点的磷酸化作用可引发强烈的坏死性凋亡。LcRIPK1、LcRIPK3和LcMLKL的活性均受caspase调控：L. crocea的CASP（LcCASP）3和6通过优先在₃₆₆VEVD₃₆₉位置切割使LcRIPK1失活，而LcCASP1/3/6则通过优先在₃₇₇CDVD₃₈₀位置切割使LcRIPK3失活。相反，LcCASP1/3/7通过在₁₃₃DAVD₁₃₆位置切割LcMLKL，使其成为持续活跃的坏死性凋亡执行分子，从而绕过RIPK1/3信号通路。对辐鳍鱼、两栖类、鸟类和哺乳类的研究表明，标准的caspase切割位点（p4-xxxD-p1）在脊椎动物的RIPK1/3中广泛存在，但关键的P4残基在硬骨鱼中有所不同，在哺乳类和两栖类中则呈现谱系特异性保守性。DxxD基序在硬骨鱼、哺乳动物和鸟类的MLKL中普遍存在，而NxxD基序则在两栖类MLKL中高度保守。这些结果表明，caspase介导的坏死性凋亡调控可能是大多数脊椎动物共有的特征。

结论

本研究揭示了硬骨鱼中由整合的caspase调控网络介导的非典型坏死性凋亡途径，为其他脊椎动物谱系中也存在保守的CASPs?MLKL途径提供了有力依据。这些发现为脊椎动物坏死性凋亡的复杂调控机制带来了新的见解。