公牛精子细胞DNA甲基化时钟揭示表观遗传衰老特征及其对繁殖力的影响

《Journal of Animal Science and Biotechnology》：DNA methylation clock in bull sperm cells reveals the epigenetic aging characteristics and impact on fertility

　　

背景：衰老是影响公牛精液品质和繁殖力的关键因素，了解精子细胞衰老的分子机制对于评估繁殖潜力和提高家畜生产力至关重要。结果：研究人员利用来自不同年龄段荷斯坦(Holstein)种公牛精子细胞全基因组亚硫酸氢盐测序(WGBS)和简化代表性亚硫酸氢盐测序(RRBS)数据构建了公牛精子细胞表观遗传时钟(epigenetic clock)。分析鉴定了年龄特异性CpG位点及不同年龄阶段特异的DNA甲基化模式。所开发的表观遗传时钟在预测公牛精子细胞生物学年龄方面表现出高准确性，表观遗传年龄加速(epigenetic age acceleration, EAA)与鲜精活力(fresh semen motility)、冷冻精液畸形率(frozen semen abnormality rate)及睾丸周长(testicular circumference)等精液品质性状显著相关。此外研究人员探讨了跨膜转运(transmembrane transport)等通路参与精子细胞衰老的机制，为精液品质变化的分子机制提供了见解。研究还建立了人与公牛精子细胞跨物种表观遗传时钟，凸显了父本生物学衰老比较研究的潜力。结论：研究发现强调了DNA甲基化调控在精子细胞衰老中的重要作用，为评估家畜繁殖潜力提供了新工具。公牛精子细胞DNA甲基化时钟的建立及与衰老相关的关键分子通路的发现增进了对精子细胞生物学的理解，并为繁殖管理和延长牛生产寿命提供了思路。

《Journal of Animal Science and Biotechnology》刊载论文解读——公牛精子细胞DNA甲基化时钟揭示表观遗传衰老特征及其对繁殖力的影响

研究背景与立题依据

衰老是引致公牛精液品质下降及繁殖力降低的重要因子，对家畜遗传改良与繁殖管理具重要影响。现有的人类表观遗传时钟(epigenetic clock, 基于DNA甲基化DNA methylation)已被广泛用于评估生物学年龄(biological age)及健康状态，但缺乏专门连接公牛年龄、精子DNA甲基化与繁殖性能的精子细胞表观遗传时钟。已有研究表明精子DNA甲基化区域(differentially methylated regions, DMRs)与公牛繁殖性状密切相关，且人类精子表观遗传时钟可通过表观遗传年龄加速(epigenetic age acceleration, EAA＝预测DNAmAge－chronological age之残差)评估生育力，因此构建公牛精子专属DNA甲基化时钟具有重要科学和应用价值。本研究旨在利用WGBS与RRBS数据开发公牛精子细胞DNA甲基化时钟，探讨EAA与精液品质及育种值关联，解析时钟相关基因分子调控机制，并尝试建立人-牛跨物种精子表观遗传时钟。

主要关键技术方法

研究人员收集59头健康荷斯坦(Holstein)公牛冷冻精液样本（49例建RRBS文库、10例建WGBS文库），整合公共数据库Holstein公牛WGBS/RRBS数据集（GSE131850、GSE119263、GSE106538）及Montbéliarde公牛RRBS数据(PRJEB46371)，并纳入人精子DNA甲基化数据(GSE223748)。提取精子基因组DNA，RRBS经MspI酶切、末端修复、接头连接、片段大小选择(40–220 bp插入片段)后亚硫酸氢盐转化(bisulfite conversion)并PCR扩增建库；WGBS将DNA片段化至约300 bp后同样行亚硫酸氢盐转化建库，Illumina平台测序。Clean reads用Bismark比对至牛参考基因组ARS-UCD1.2并去重复，CpG位点甲基化水平由MethPipe计算（覆盖度≥5或≥10 reads），识别低甲基化区域(hypomethylated regions, HMRs)及DMRs。通过CpGassoc做年龄-甲基化关联分析筛选年龄相关CpG(FDR＜0.05且高变异四分位)，采用弹性网络惩罚回归(elastic net regression, α＝0.5)配合留一法交叉验证(leave-one-out cross-validation, LOOCV)构建表观遗传时钟模型，Pearson相关系数(r)与平均绝对误差(mean absolute error, MAE)评估性能。EAA定义为预测年龄对实际年龄回归残差，用多元线性回归做调节分析(moderating analysis)检验精液品质及育种值与EAA关联。用EpigeneticPacemaker拟合表观遗传状态随年龄变化，对时钟关联基因组区域与牛复杂性状GWAS显著SNP做富集分析，GO功能注释由Revigo汇总。跨物种时钟将牛月龄/人岁按最大寿命标准化做相对年龄转换后联合建模。

研究结果

不同年龄段公牛精子细胞DNA甲基化水平分布(The distribution of DNA methylation levels across different age stages)

对49头RRBS样本做无监督层次聚类，识别出≤25月、26–59月、≥60月三个年龄阶段集群，剔除明显偏离个体后保留35例做下游分析。整体CpG平均甲基化水平随年龄增长升高。启动子区甲基化最低(近转录起始位点TSS)，向转录终止位点(TTS)及其下游递增。26–59月阶段未甲基化CpG(β＝mCG/CG＝0)比例最低，低甲基化区域(HMRs)总数及总基因组长度以26–59月最多，各阶段均存在阶段特异(unique) HMRs。阶段特异HMR关联基因GO显示：≤25月富集细胞稳态与离子跨膜转运；26–59月富集细胞发育、黑色素细胞分化及昼夜节律基因表达调控；≥60月富集较广泛过程（包括胆固醇吸收调控、紫外响应等）。

公牛精子细胞DNA甲基化时钟年龄关联CpG特征鉴定(Identification of age-associated CpG features for sperm cell DNA methylation clock development in stud bulls)

对35例做全表观基因组关联分析(EWAS)筛得7370个年龄相关CpG(FDR＜0.05)，取甲基化标准差上四分位高变CpG（关联基因富集信号转导与蛋白定位）。91.76％的年龄相关CpG随年龄甲基化升高，高变子集达98.48％。以此35例RRBS数据初建时钟，LOOCV得r＝0.85，MAE＝7.42月。

整合荷斯坦公牛WGBS与RRBS数据的DNA甲基化时钟(An integrated DNA methylation clock for Holstein bulls using in-house and public datasets)

整合自测10例WGBS＋公共24例WGBS(12–116月)与RRBS数据，无监督聚类重现三阶段，剔除极端不符个体后保留78例建模。RRBS衍生时钟在WGBS数据具良好跨平台转移性(r＝0.91–0.93)。整合78例所建时钟：覆盖度≥5×时r＝0.94、MAE＝5.49月；≥10×时r＝0.95、MAE＝5.27月。独立Holstein WGBS外部验证队列(n＝9)中r＝0.88、MAE＝7.08月。不同标准下时钟CpG位点重叠有限。

调节分析(Moderation analysis)

以最优时钟(78例, ≥10×)所得EAA为因变量做多元线性回归，发现首次采精鲜精活力(sperm motility at first ejaculation, MS_1st)、冷冻后异常率(abnormal rate after freezing, ARAF)及睾丸周长(testicular circumference, SC)与EAA显著关联，表明这些精液品质/体型性状与公牛表观遗传衰老有关。

表观遗传加速关联区域功能注释(Functional annotation of regions associated with epigenetic acceleration)

EAA在各年龄阶段呈非线性：≤25月与≥60月中位数＜0（表观遗传"年轻化"），26–59月中位数＞0（表观遗传加速）。各阶段取EAA最高/最低各3例做DMR分析，GO显示26–59月及≥60月阶段EAA相关DMR共同富集神经元投射(neuron projection)与跨膜转运(transmembrane transport)，后者与精子发生及细胞功能直接相关。

精子细胞DNA甲基化时钟GWAS富集分析(GWAS enrichment analysis for sperm cell DNA methylation clock)

时钟关联基因组区域与49项牛复杂性状GWAS显著SNP做富集，精液品质性状（射精量VE、精子浓度SC、初始活力MS、总精子数NSP、总活力精子数NMSP）及父本受胎率(sire conception rate, SCR)GWAS信号显著富集于时钟区域，提示时钟CpG参与复杂性状及衰老调控。

跨物种、跨品种及跨年龄阶段精子表观遗传时钟探索(Exploring the potential of sperm epigenetic clocks across species, breeds, and age stages)

Epigenetic Pacemaker显示公牛表观遗传状态随年龄呈平方根函数关系（早期变化快后期减缓）。人-牛精子数据联合按相对年龄转换建跨物种时钟可捕捉两物种年龄关联信号(r＝0.72, MAE＝3.21)。Holstein(n＝78)＋Montbéliarde(n＝61)跨品种时钟LOOCV r＝0.92、MAE＝5.36月。≤25月龄青年公牛专属时钟(Holstein n＝28) r＝0.94、MAE＝1.48月；Holstein(n＝28)与Montbéliarde(n＝55)联合青年公牛时钟r＝0.90、MAE＝1.21月，青年阶段时钟CpG平均甲基化模式品种间保守，个别CpG位点存在品种特异年龄轨迹差异。≥60月阶段因样本少未能获高相关性时钟。

讨论与结论翻译

讨论指出本研究首次报道公牛精子细胞DNA甲基化时钟具跨平台高准确性(r＝0.95, MAE＝5.27月)，EAA关联基因富集跨膜转运通路，且通过基因组liftover鉴定人与公牛精子共有正交(orthologous)时钟CpG位点实现跨物种年龄预测(r＝0.72)。年龄相关CpG中91.76％随龄高甲基化，与既往人及动物研究一致。阶段特异HMR功能反映不同发育/生理阶段潜在调控，跨品种青年公牛共享甲基化衰老模式但存品种差异。局限性含高龄组(≥60月)样本偏少及时钟CpG功能尚待体内验证。结论：研究人员开发了高精度公牛精子细胞表观遗传时钟，为评估精子生物学年龄及其与精液品质和繁殖力的关系提供新工具。EAA与鲜精活力、冻精异常率及睾丸周长显著相关，跨膜转运通路在精子衰老中起核心作用。人-牛跨物种精子表观遗传时钟为父本生物学衰老比较研究提供新可能，对理解精子细胞生物学、优化繁殖管理及延长家畜生产寿命具重要意义。