涉及SlATP-PRT和SlAPRT1的能量电荷对番茄果实生长-成熟转变的调控

《Molecular Horticulture》：Regulation of the growth-to-ripening transition in tomato fruits by energy charge involving SlATP-PRT and SlAPRT1

　　

番茄果实的生命周期主要包括两个不同的阶段：初期的生长发育阶段，以及随后的成熟和衰老阶段。然而，最初触发从能量密集型生长阶段向成熟阶段转变的机制仍不清楚。首先，研究人员发现果实能量电荷在该转变前显著降低，这可能由腺苷一磷酸（AMP）和组氨酸（His）水平的升高引起。其次，研究人员通过基因组编辑和过表达技术，构建了针对AMP补救途径关键酶（SlAPRT1）和His生物合成途径关键酶（SlATP-PRT）的转基因番茄植株。所有转基因植株均导致果实成熟受到严重抑制，这与野生型植株的外源性AMP处理结果一致，主要原因是能量电荷升高。特别地，Slatp-prt突变体果实几乎无法产生乙烯或启动成熟，但外源性His处理可以恢复其能量电荷和成熟启动。最后，通过外源性His处理降低能量电荷，也能有效加速野生型果实在植株上和采后的生长-成熟转变。综上所述，该研究揭示了低能量电荷和高His水平共同触发番茄果实生长-成熟转变，为成熟启动机制提供了新颖且有价值的见解。

番茄作为典型的呼吸跃变型果实，是果实成熟研究的模式材料，其生命周期经历生长发育与成熟衰老两个主要阶段。尽管已有大量研究围绕激素调控、环境条件、转录因子及表观遗传等因素展开，但触发果实从生长阶段向成熟阶段转变的初始生理与分子机制仍不清晰。能量稳态对生物体的生长发育至关重要，果实生长阶段能量供需高于成熟阶段，这一能量状态转变可能是诱导成熟启动的关键因素。为此，研究人员聚焦于能量电荷变化在番茄果实生长-成熟转变中的作用机制，相关成果发表于《Molecular Horticulture》。

本研究所用番茄材料为番茄栽培种Micro-Tom，野生型种子购自C.M. Rick番茄遗传资源中心，nr、rin和nor突变体来自四川大学刘明春教授实验室。技术方法主要包括：病毒诱导基因沉默（VIGS）用于瞬时验证基因功能；CRISPR/Cas9基因组编辑构建SlATP-PRT和SlAPRT1基因敲除突变体，并构建CaMV 2×35S启动子驱动的过表达载体获得转基因植株；采用4D-DIA（四维数据非依赖采集）蛋白质组学技术定量分析SlATP-PRT蛋白丰度；通过高效液相色谱测定ATP、ADP、AMP、腺苷（Ado）、腺嘌呤（Ade）含量，超高液相色谱-质谱联用测定游离His含量，并计算能量电荷[(ATP+1/2ADP)/(ATP+ADP+AMP)]；利用便携式CO₂分析仪测定呼吸强度，气相色谱测定乙烯产生量；转录组测序（RNA-seq）分析基因表达差异，并通过RT-qPCR验证关键基因。

**能量电荷与His含量在番茄果实成熟转变期间的变化**

研究人员测定了番茄果实从生长期到自然成熟期细胞能量电荷相关代谢物及CO₂的变化。结果表明，果实膨大早期（10–20 DPA，开花后天数），CO₂、ATP、ADP、Ado和Ade水平显著降低，AMP含量未检出，能量电荷维持较高水平；膨大后期（20–30 DPA），ATP含量降至最低，AMP含量上升，导致能量电荷显著下降；果实从生长向成熟转变期间（30 DPA-MG阶段至Br阶段），ATP、ADP和AMP水平显著升高，能量电荷进一步降低，CO₂产生量在MG阶段达最低后于Br阶段显著升高。尤为重要的是，能量电荷从0.6逐渐降至0.1，而AMP含量从未检出升至225.3 nmol g^?1 FW，能量电荷变化主要由AMP含量变化驱动。同时，游离His含量在30 DPA-Br阶段显著增加，这与之前报道的ATP可作为限素酶ATP-PRT底物促进His生物合成一致，且He生物合成途径亦参与AMP的生物合成。

**内源性AMP和His生物合成对番茄果实成熟转变至关重要**

AMP补救途径和His生物合成途径是番茄果实生长后期AMP水平升高的主要贡献者，APRT和ATP-PRT分别是这两条途径的关键酶。在番茄基因组中，SlAPRT1（Solyc04g077970）的同源基因Solyc08g079020在此过程中的表达持续下降且表达量远低于SlAPRT1，表明SlAPRT1起主导作用；SlATP-PRT（Solyc01g103750）则无番茄同源基因。SlAPRT1和SlATP-PRT在果皮中的表达在生长-成熟转变期间相对稳定，之后显著降低，SlAPRT1在果肉组织中表达显著增加。研究人员通过VIGS在Micro-Tom中成功验证两者参与果实成熟：靶向SlATP-PRT或SlAPRT1的VIGS均导致果实成熟延迟且着色不均。进一步构建转基因植株时发现，SlATP-PRT和SlAPRT1基因敲除纯合子均无法获得，推测这些基因对番茄不可或缺；最终获得3个Slatp-prt杂合突变体，分别建立9个OE-SlATP-PRT和8个OE-SlAPRT1独立过表达系。

Slatp-prt 3#、5#和7#均表现出包括果实成熟在内的严重缺陷，Br阶段延迟约20天且无法转红，与著名 spontaneous 突变体nor相当。4D-DIA蛋白质组学显示Slatp-prt 3#突变体果实中SlATP-PRT蛋白丰度降至野生型的45.85%。过表达SlATP-PRT或SlAPRT1同样阻碍成熟转变，OE-SlATP-PRT的1#、2#、8#系和OE-SlAPRT1的2#、4#、8#系Br阶段均延迟约6天。由于ATP-PRT和APRT可能竞争性利用有限底物5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP），两者均可能影响AMP和His生物合成，故表达水平变化不直接反映代谢物含量变化。

**SlATP-PRT和SlAPRT1主要通过调控能量电荷调节番茄果实成熟转变**

SlATP-PRT和SlAPRT1对果实成熟相关生理特性和品质形成有显著影响。与野生型相比，His生物合成缺陷的Slatp-prt突变体果实几乎完全抑制了系统II乙烯合成、果实软化和番茄红素合成，单果重和单果种子数显著降低。100 μmol L^?1外源性His灌溉处理显著增加乙烯产生并恢复成熟表型，降低果实硬度、提高番茄红素含量、单果重和种子数。OE-SlATP-PRT和OE-SlAPRT1果实的系统II乙烯合成也显著延迟，表现出品质发育缺陷：果实软化和番茄红素合成受强烈抑制，单果重显著下降，OE-SlAPRT1单果种子数显著减少而OE-SlATP-PRT显著增加。

为阐明机制，研究人员测定35 DPA果实中His、AMP含量和能量电荷。与野生型相比，SlATP-PRT基因敲除导致His和AMP含量降低、能量电荷升高；过表达SlATP-PRT则His含量略升、AMP含量降低，同样升高能量电荷；过表达SlAPRT1导致His和AMP含量均降低，能量电荷升高。所有延迟成熟的转基因果实均表现较高能量电荷，表明升高的能量电荷是延迟成熟表型的关键决定因素。Slatp-prt突变体能量电荷最高（0.6），47 DPA内无法启动成熟；外源性His处理将其能量电荷降至0.4，使突变体能正常转入成熟。这表明充足的His对降低番茄果实能量电荷至关重要。然而，高His含量不一定伴随低能量电荷，如OE-SlATP-PRT果实His水平略高但能量电荷也升高。

**外源性能量电荷相关代谢物处理调控番茄果实成熟转变**

为确认能量电荷变化对成熟启动的影响，研究人员在果实生长早期（10和15 DPA）分别用100 μmol L^?1 ATP、无机磷（Pi）、ADP、AMP、Ado或Ade灌溉野生型番茄植株。ATP、Pi、Ado或Ade处理均导致35 DPA果实内源性AMP含量增加，能量电荷降至约0.2，加速成熟转变约3天；ADP处理无显著效果。与OE-SlATP-PRT和OE-SlAPRT1果实类似，外源性AMP处理反而导致35 DPA果实内源性AMP含量异常降低，从而升高能量电荷。补充等量Pi或ATP可有效降低AMP处理果实的能量电荷，补偿延迟成熟表型，ATP处理显著促进色泽转变、软化和种子产生。能量电荷降低是番茄果实生长-成熟转变的必要条件。

**外源性His处理促进番茄果实能量电荷降低和成熟转变**

鉴于Slatp-prt突变体His缺乏导致能量电荷升高，研究人员推测高含量游离His可能促进能量电荷降低。用100 μmol L^?1 His或ATP-PRT激活剂3-(2-噻吩基)-L-丙氨酸（TIH）灌溉野生型番茄植株，两者均显著提高32 DPA果实的His和AMP水平，降低能量电荷，提前成熟约6天，促进色泽转变和软化。TIH在降低能量电荷方面比等浓度His、ATP或Pi效果更显著，导致更早的成熟启动。RNA-seq分析显示，His生物合成缺陷的Slatp-prt突变体与野生型果实在成熟转变期间的差异表达基因主要富集于植物激素信号转导途径。大量在野生型中因低能量电荷而上调的基因在Slatp-prt突变体中被显著抑制，包括促进或参与系统II乙烯合成的关键基因（SlDML2、SlRIN、SlNOR、SlACS2、SlACS4、SlACO1、SlACO3）、信号转导（SlCTR1、SlETR3、SlETR4、SlETR6、SlETR7、SlEBF1、SlEBF2、SlEBF3）及下游响应基因（SlE8、SlPSY1、SlPG2a、SlPL、SlTBG4）。这些差异表达基因编码的蛋白质几乎均富含His残基，其中DNA去甲基化酶SlDML2的His残基数最高（47个），SlPL的His比例最大（4.22%）。外源性His处理显著上调Slatp-prt突变体中这些基因的表达，有效补偿成熟缺陷。

**His在系统II乙烯产生之前诱导未成熟番茄果实成熟**

采收的未成熟番茄果实（26 DPA）不能正常启动成熟，而ATP和His处理均能促进其开始成熟并最终完全转红。ATP对His缺陷突变体Slatp-prt果实成熟启动的促进效果显著减弱，提前用低浓度His（10 μmol L^?1）灌溉可增强ATP效果。外源性乙烯处理不能诱导采收的26 DPA番茄果实成熟，而His处理有效促进，1-MCP部分抑制His诱导的成熟启动，表明His部分通过乙烯依赖途径发挥作用。在自发成熟缺陷突变体rin、nor和nr中，His处理也能提前转色阶段，说明其可通过乙烯非依赖途径促进成熟转变。在自然成熟过程中，His含量显著增加（20–30 DPA）发生在转录因子SlRIN、SlNOR以及系统II乙烯合成相关SlACS2、SlACS4显著上调之前，表明His诱导的成熟转变先于SlRIN、SlNOR和系统II乙烯。

讨论部分系统分析了能量稳态与果实成熟的关系。文章指出，细胞能量电荷在番茄果实膨大后期（20–30 DPA）降低，这是由于ATP含量最低而AMP水平略有增加所致。这种低能量状态有利于上调众多成熟相关基因的表达，包括SlDML2、SlRIN和SlNOR等关键调控基因，从而促进成熟转变。这种低能量状态主要通过AMP激活蛋白激酶（AMPK）感知，其植物同源物SnRK1在低能量状态下被激活，通过磷酸化下游调控因子（如转录因子bZIP63、WRKYs、NACs及表观遗传因子H3K27me3去甲基化酶JMJ705）协调广泛的转录重编程。在番茄果实中，SnRK1在成熟转变的低能量状态下发挥关键调控作用，过表达苹果SnRK1可加速转基因番茄果实成熟启动约10天，而SlSnRK1沉默则导致成熟延迟或完全抑制。

同时，生长-成熟转变期间ATP含量的增加（30 DPA-Br阶段）是成熟启动的助推器，因为ATP是所有其他核苷酸生物合成的基础，也是乙烯和His等众多成熟相关因子合成的关键底物。外源性ATP灌溉增加内源性AMP含量以降低能量电荷，从而提前成熟转变；向采收的未成熟果实注射外源性ATP也能加速成熟启动。这与ATP对已启动成熟果实的延迟作用形成对比，说明外源性ATP处理效果取决于果实发育阶段。此外，外源性His能增强ATP对采收未成熟番茄果实成熟启动的促进效果。His处理降低能量电荷从而促进生长-成熟转变，该效应发生在SlRIN、SlNOR和系统II乙烯参与之前，既通过乙烯依赖途径也涉及乙烯非依赖途径。His作为植物生长发育所必需的氨基酸，在番茄蛋白中仅占2.42%，但在关键成熟相关蛋白中比例相对较高，其有限储备可能制约这些关键蛋白的合成，因此His的积累可能通过促进这些必需蛋白的高效合成来推动成熟转变。

研究结论部分指出：该研究强调了降低的能量电荷和升高的游离His水平在诱导番茄果实生长-成熟转变中的关键作用，并提出了机制假说。AMP和His水平的增加导致番茄果实生长后期能量电荷降低，这种能量电荷的降低诱导了广泛的转录重编程，包括上调与成熟启动相关的基因表达。在番茄果实成熟启动时，游离His水平的升高促进了SlDML2、SlRIN、SlNOR和SlETR3等成熟相关蛋白的合成，最终触发系统II乙烯的合成和番茄果实的成熟转变。