尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici, Fol) milR1介导番茄SlyAHL基因DNA甲基化赋予枯萎病抗性的机制研究

《Phytopathology Research》：DNA methylation of SlyAHL mediated by Fol-milR1 confers resistance to Fusarium wilt disease in tomato

　　

摘要：番茄(Solanum lycopersicum)是全球广泛栽培的营养丰富的蔬菜作物。由番茄专化型尖孢镰刀菌(Fusarium oxysorprum f.sp. lycopersici, Fol)引起的番茄枯萎病是一种土传真菌病害，在全球范围内造成巨大的番茄农业生产经济损失。近期关于小RNA(small RNA, sRNA)介导的DNA甲基化(RNA-directed DNA methylation, RdDM)在植物抗病中作用的研究备受关注，但真菌病原物通过跨界sRNA介导寄主DNA甲基化从而拮抗番茄枯萎病的机制尚不清楚。研究人员此前已证实Fol源sRNA效应子Fol-milR1在病原菌侵染过程中转运进入番茄细胞，并通过结合SlyAGO4a劫持番茄免疫系统。本研究进一步探究Fol-milR1-SlyAGO4a如何通过调控番茄抗病基因的DNA甲基化参与枯萎病抗性反应。研究人员以枯萎病感病番茄品种Moneymaker分别接种水(对照)、Fol野生型菌株(Fol-WT)及Fol-milR1敲除菌株(Fol-milR1_KO)，进行全基因组甲基化测序。结果显示Solyc08g080960(命名为SlyAHL)的甲基化水平与番茄中Fol-milR1的表达相关联，且该基因编码区甲基化类型主要为CG型。SlyAHL通过调控活性氧(reactive oxygen species, ROS)积累参与番茄枯萎病抗性。综上，Fol-milR1-SlyAGO4a-SlyAHL功能模块介导番茄枯萎病抗性，为番茄枯萎病的绿色防控提供了潜在策略。

论文解读：Fol-milR1介导SlyAHL DNA甲基化赋予番茄尖孢镰刀菌枯萎病抗性的机制

本文发表于《Phytopathology Research》。番茄(Solanum lycopersicum)枯萎病由尖孢镰刀菌番茄专化型(Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici, Fol)引起，属土传病害，危害严重且防治困难。RNA定向DNA甲基化(RNA-directed DNA methylation, RdDM)途径在植物免疫中发挥重要作用，病原真菌跨界sRNA作为效应子调控寄主基因甲基化进而参与植物—病原菌互作的机制是近年研究热点，但Fol分泌sRNA跨界调控番茄抗病基因DNA甲基化以影响枯萎病抗/感反应的机制尚未见报道。研究人员前期发现Fol分泌sRNA效应子Fol-milR1可转运进番茄细胞并结合SlyAGO4a，本研究在此基础上探究Fol-milR1-SlyAGO4a模块是否通过RdDM途径甲基化功能基因以介导枯萎病抗性。

主要关键技术方法

研究人员选用枯萎病感病近等基因系番茄品种Moneymaker(MM, i2/i2)及抗病品种Motelle(Mot, I2/I2)为材料，设H₂O(mock)、Fol-WT(野生型菌株)、Fol-milR1_KO(Fol-milR1敲除突变株)三个处理组。采用全基因组重亚硫酸氢盐测序(Whole-genome bisulfite sequencing, WGBS)比较差异甲基化区域；利用甲基化敏感性酶切PCR(CHOP-PCR)及亚硫酸氢盐测序PCR(Bisulfite sequencing PCR, BSP)验证靶基因甲基化状态；通过qRT-PCR检测基因转录水平；构建SlyAHL过表达(Moneymaker背景)及CRISPR-Cas9敲除(Motelle背景)转基因株系，结合病情指数、病原菌生物量(PCR定量Fol核糖体DNA基因间区IGS)、番红(Media)染色与茎段再培养评估抗病性；采用DAB(检测H₂O₂)与NBT(检测超氧阴离子•O₂^?)染色及H₂O₂含量测定分析活性氧(reactive oxygen species, ROS)积累。

研究结果

The Fol-milR1-SlyAGO4a module mediates DNA methylation of the tomato genome

研究人员对H₂O、Fol-WT及Fol-milR1_KO处理的Moneymaker进行WGBS分析，发现Fol-WT处理整体基因组DNA甲基化水平高于mock及Fol-milR1_KO处理，甲基化类型以CG和CHG为主，CHH较低；KEGG分析显示差异甲基化基因显著富集于植物—病原互作通路。表明Fol侵染特异性改变番茄基因组DNA甲基化水平，且该过程由Fol-milR1-SlyAGO4a模块介导。

Methylation level of SlyAHL is associated with the presence of Fol-milR1

比对WGBS数据筛选到候选基因Solyc08g080960(编码AT-hook基序核定位蛋白，命名SlyAHL)，其甲基化水平在Fol-WT处理下升高，Fol-milR1敲除后该现象消失。CHOP-PCR(HpaII消化，识别mCG)显示Fol-milR1-SlyAGO4a模块直接改变SlyAHL甲基化，ScrFI(mCHG敏感)无差异；BSP证实SlyAHL开放阅读框(open reading frame, ORF)区内CG位点甲基化率在Fol-WT感染后显著升高，Fol-milR1_KO消除此差异。结论：Fol-milR1调控SlyAHL ORF区CG型胞嘧啶甲基化。

The methylation of SlyAHL is mainly the CG-type in the ORF region

BSP细化分析显示SlyAHL ORF区甲基化以CG型为主(感病品种Fol-WT处理下约72%，抗病品种约85%)，CHG及CHH无显著差异；Fol-milR1_KO处理取消CG甲基化升高。qRT-PCR显示RdDM途径中仅DNA甲基转移酶结构域重排家族基因SlyDRM7在Fol-WT早期侵染时显著诱导表达，且该诱导依赖Fol-milR1。提示SlyAHL甲基化可能由SlyDRM7介导，并与Fol-milR1-SlyAGO4a模块相关。

The Fol-milR1-SlyAGO4a module mediates the expression of SlyAHL by DNA methylation

Fol-WT侵染过程中SlyAHL转录水平持续受抑，Fol-milR1_KO使其抑制更显著。不同组织(茎、叶)及PDA平板侵染试验均显示：Fol-WT感染引起SlyAHL ORF区CG甲基化升高与其mRNA表达下调呈对应关系。结论：Fol-milR1-SlyAGO4a模块通过DNA甲基化(主要是CG型)介导SlyAHL表达抑制以响应Fol侵染。

SlyAHL functions as a positive factor in response to Fol infection

SlyAHL过表达株系(Moneymaker背景)枯萎病症状减轻、病原菌生物量降低、维管束褐变减少；CRISPR-Cas9敲除株系(Motelle背景)则病情加重、病原菌增多。DAB与NBT染色及H₂O₂含量测定显示SlyAHL正向调控侵染部位H₂O₂和•O₂^?积累。结论：SlyAHL通过调控ROS积累作为正调控因子参与番茄对Fol的抗性。

讨论与结论

讨论指出病原sRNA跨界结合寄主AGO蛋白参与RdDM已有报道，本研究进一步证明Fol-milR1-SlyAGO4a模块介导番茄抗性基因SlyAHL ORF区CG型DNA甲基化并抑制其表达；SlyDRM7可能为该RdDM途径中负责建立甲基化的DOMAINS REARRANGED METHYLASE(DRM)；SlyAHL正调控番茄对Fol的抗性且通过促进ROS积累实现。传统RdDM典型产物为非对称CHH甲基化，而本研究发现SlyAHL主要受CG甲基化调控，暗示番茄中存在AGO4参与的CG甲基化调控新模式。

结论(译文)：Fol侵染期间，sRNA效应子Fol-milR1被转运入番茄寄主细胞，通过与SlyAGO4a互作启动重要枯萎病抗性基因SlyAHL的甲基化，Fol-milR1-SlyAGO4a-SlyAHL功能模块由此破坏寄主防御机制以利于病原菌成功侵染。研究人员推测Fol-milR1-SlyAGO4a-SlyAHL RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex, RISC)通过RdDM途径参与Fol与番茄寄主的互作。