犬淋巴瘤与白血病中PI3K/mTOR双重抑制剂VDC597的体外作用

《Veterinary Oncology》：In vitro effects of the PI3K/mTOR dual-inhibitor, VDC597, in canine lymphoma and leukemia

　　

摘要

背景
造血系统肿瘤是犬最常见的肿瘤类型之一，亟需推进治疗进展以改善临床结局。磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶（PI3K）、AKT丝氨酸/苏氨酸激酶（AKT）及雷帕霉素机制性靶蛋白（mTOR）信号通路在犬造血系统肿瘤中常发生失调，并与较差预后相关。靶向性信号转导抑制为改进该类肿瘤治疗提供了潜在有益途径。

方法
本研究旨在体外评估PI3K/mTOR双重抑制剂VDC597对犬淋巴瘤和白血病细胞的疗效，并采用免疫组织化学（IHC）对自发性犬B细胞淋巴瘤中的该信号通路进行评价。研究人员采用细胞活力与生长抑制实验、活细胞成像、细胞死亡实验、血管内皮生长因子（VEGF）酶联免疫吸附测定（ELISA），以及蛋白质印迹（western blot）和免疫组织化学评估信号转导激活状态，从而检测VDC597单药及其与标准治疗化疗药物联用时的体外效应。另对84只诊断为自发性B细胞淋巴瘤犬的118份淋巴结样本进行免疫组织化学检测及通路激活评分。统计学显著性检验及组间比较根据需要采用方差分析（ANOVA）、Kruskal-Wallis检验、Mann-Whitney检验、双尾t检验或Mantel-Cox方法。

结果
VDC597在体外以剂量依赖方式抑制犬淋巴瘤/白血病细胞中的PI3K/AKT/mTOR信号转导，降低细胞活力和增殖，促进细胞死亡，并抑制促血管生成因子的产生。反映通路激活的磷酸化蛋白在自发性犬B细胞淋巴瘤样本中的表达具有变异性。在这些样本中，磷酸化蛋白表达与2项预后指标之间呈现与假设一致的相关性，但与结局数据无相关性。主要组织相容性复合体Ⅱ类（MHC-II）表达与磷酸化AKT（pAKT）相关，而治疗后复发状态与磷酸化真核翻译起始因子4E结合蛋白1（p4EBP1）表达相关。

结论
上述结果提示，PI3K/mTOR抑制可能成为治疗犬淋巴瘤和白血病的一种有用抗肿瘤策略。然而，免疫组织化学结果提示，犬B细胞淋巴瘤中的信号通路激活存在明显异质性，仍需进一步研究以阐明该肿瘤类型中通路激活的预后学作用。

本文发表于《Veterinary Oncology》，围绕犬造血系统肿瘤中PI3K-AKT-mTOR信号轴的异常激活及其可治疗性展开。犬淋巴瘤，尤其是B细胞淋巴瘤，是犬最常见的肿瘤类型之一，临床上虽然CHOP方案可获得初始缓解，但总体生存改善有限，复发后救援治疗反应率和持续时间通常更差。犬慢性淋巴细胞白血病的治疗也多以姑息控制为主，难以达到真正缓解。既往研究显示，PI3K-AKT-mTOR通路在犬淋巴系统恶性肿瘤中常见突变、异常表达和持续激活，并与不良生物学行为相关，因此，对该通路实施靶向抑制具有明确理论基础。尤其是单节点抑制容易因反馈机制导致反应不完全或耐药，多节点联合阻断因而具有更强的机制合理性。VDC597可同时抑制PI3K以及mTOR复合体1和2（mTORC1、mTORC2），因此被认为有望实现更完全的通路封闭。

研究人员据此开展体外功能研究，并结合临床来源自发性犬B细胞淋巴瘤样本进行免疫组织化学验证，以回答两个关键问题：其一，VDC597是否能够抑制犬B细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病细胞的恶性表型；其二，PI3K-AKT-mTOR通路在临床自发性犬B细胞淋巴瘤中的激活程度是否与预后指标或结局相关。研究结果表明，VDC597可在体外剂量依赖性抑制信号转导、降低细胞活力与增殖、促进细胞死亡，并减少血管内皮生长因子（VEGF，促血管生成因子）产生；与此同时，临床犬B细胞淋巴瘤样本中磷酸化蛋白表达存在明显异质性，仅与部分预后指标相关，而未与无进展间期或生存时间形成显著相关。这说明VDC597具有明确体外抗肿瘤活性，但通路激活作为犬B细胞淋巴瘤预后标志物的价值仍需进一步厘清。

本研究主要采用以下关键技术方法：研究对象包括犬B细胞淋巴瘤细胞系1771、犬慢性淋巴细胞白血病细胞系CLL1390，以及来自84只自发性B细胞淋巴瘤患犬的118份淋巴结甲醛固定石蜡包埋（FFPE）样本。体外部分通过resazurin细胞活力/生长抑制实验、Incucyte活细胞实时成像与YOYO-1死亡染色评估增殖和细胞死亡；采用western blot和免疫组织化学（IHC）检测pAKT（S473）与p4EBP1（T46）以判断PI3K-AKT-mTOR通路活化状态；采用VEGF ELISA评估促血管生成分泌功能；联合用药分析使用Chou-Talalay法计算组合指数（CI）。临床样本部分通过组织芯片（TMA）、人工Allred评分、人工智能（AI）辅助H-score与Allred评分，并结合流式细胞术和临床随访资料进行统计相关分析。

研究结果

Inhibition of AKT and 4EBP1 phosphorylation
研究人员首先通过western blot验证VDC597对关键信号节点的抑制作用。结果显示，在1771和CLL1390两种细胞中，VDC597处理24 h后均可使pAKT（S473）呈剂量依赖性下降，证明其能够有效抑制PI3K-AKT-mTOR信号传导。CLL1390对药物更敏感，在0.2 μM和1 μM下pAKT（S473）抑制均更显著；1771则在1 μM时出现显著下降。进一步的时间梯度实验在1771细胞中显示，1 μM VDC597可快速起效并在24 h内维持对pAKT（S473）的抑制；对下游靶标p4EBP1（T46）的抑制在0.5、1和2 h尤为明显。该结果说明VDC597不仅抑制AKT磷酸化，而且能够抑制mTOR下游翻译调控信号。

Immunohistochemical evaluation of AKT and 4EBP1 phosphorylation in vitro
为验证形态学层面的信号抑制，研究人员对体外处理后的细胞石蜡包埋样本进行IHC检测。结果显示，两种细胞在接受1 μM VDC597处理24 h后，pAKT（S473）的核周和胞质免疫反应性下降，p4EBP1（T46）的胞质免疫反应性亦下降。1771中的降低幅度小于CLL1390，与western blot所得敏感性差异一致。该部分结果从组织学证据进一步支持VDC597可在细胞水平抑制整条PI3K-AKT-mTOR信号轴。

研究人员随后将IHC拓展至临床样本，对84只犬的118份自发性B细胞淋巴瘤淋巴结样本进行分析。人工Allred评分、AI计算Allred评分与AI H-score之间相关性良好，说明评分方法总体一致。然而，pAKT（S473）与p4EBP1（T46）之间并无强相关，提示临床样本中通路激活具有复杂性与异质性。进一步相关分析显示，较低的MHC-II表达与较高的pAKT（S473）评分相关；而CHOP治疗后复发样本的p4EBP1（T46）评分高于治疗前样本，尤其在配对样本的人工评分中仍具统计学意义。但pAKT（S473）或p4EBP1（T46）评分与无进展间期、生存时间、WHO分期/亚分期及流式免疫表型指标均未见显著相关。

Cell growth inhibition and cell death assays
在功能学层面，VDC597对两种细胞系均显示明确的体外生长抑制作用。1771在0.625、1.25和2.5 μM时活力显著下降，而CLL1390在所有测试浓度下均有显著抑制，提示后者更敏感。两种细胞系的半数抑制浓度（IC₅₀）位于或接近可药理达到范围，其中CLL1390为1.41 μM，1771为2.56 μM。为区分生长抑制与细胞死亡，研究人员采用实时活细胞成像技术进一步检测1771的死亡变化，结果显示VDC597可剂量依赖性增加细胞死亡，0.25、0.5和1 μM时死亡比例均显著升高。这表明VDC597不仅抑制细胞增殖，也直接促进肿瘤细胞死亡。

在联合治疗方面，研究人员考察了VDC597与地塞米松、阿霉素和长春新碱联用的效果。结果显示，加入VDC597后，上述药物对1771的生长抑制均增强，IC₅₀均下降。组合指数分析表明，VDC597与地塞米松呈协同作用（CI<1），尤其在较低浓度时更明显；与阿霉素总体表现为相加至轻度协同，但阿霉素最高浓度时出现拮抗；与长春新碱则主要表现为相加至轻度拮抗。该结果提示，VDC597并非与所有常规化疗药物均等协同，而其与糖皮质激素联用的潜力尤为突出。

VEGF production
考虑到PI3K-AKT-mTOR通路在肿瘤血管生成中的作用，研究人员检测了VDC597对VEGF分泌的影响。结果表明，在1771和CLL1390中，VDC597均可剂量依赖性降低VEGF产生；1771在1 μM时达到显著性，而CLL1390在0.25、0.5和1 μM时均显著下降，提示CLL1390对药物反应更强。该结果说明VDC597除直接影响肿瘤细胞存活外，还可能通过抑制促血管生成旁分泌信号发挥抗肿瘤效应。

讨论总结
讨论部分强调，PI3K-AKT-mTOR信号失衡是犬及人类多种肿瘤的重要致癌机制，参与细胞存活、增殖、代谢和血管生成。单一节点抑制因反馈激活常导致抑制不完全，而VDC597通过同时作用于PI3K、mTORC1和mTORC2，有望增强通路封闭效果。本研究体外数据支持这一机制推断：药物可同时下调pAKT（S473）与p4EBP1（T46），并导致细胞活力下降、细胞死亡增加及VEGF分泌减少。CLL1390较1771更敏感，研究人员认为这可能与其较高的基础pAKT（S473）表达有关，提示通路高活化状态可能成为药物敏感性的潜在线索。

对于临床样本，研究人员认为犬自发性B细胞淋巴瘤中PI3K-AKT-mTOR通路活化程度存在明显个体差异。pAKT与低MHC-II表达相关、p4EBP1与复发状态相关，这些发现具有一定生物学意义，但由于它们未与无进展间期、生存时间等关键结局指标一致相关，因此需谨慎解读，避免过度外推。文章同时明确指出研究局限，包括仅检测1株B细胞淋巴瘤细胞系和1株慢性淋巴细胞白血病细胞系、缺乏更广泛细胞谱系验证、未评估急性淋巴细胞白血病及T细胞淋巴瘤、未进行洗脱实验，也未完成更大规模体内安全性与有效性研究。IHC分析方面，仅检测了pAKT（S473）而未能可靠检测pAKT（T308），对4EBP1磷酸化的上游机制解释仍有限；AI与人工评分方法也各自存在技术局限。

研究结论翻译
VDC597可通过IHC和western blot所检测到的方式抑制PI3K-AKT-mTOR信号转导，并在体外抑制犬B细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病细胞系的增殖、促进细胞死亡、抑制VEGF产生。自发性犬B细胞淋巴瘤组织切片中，与PI3K-AKT-mTOR信号相关的磷酸化蛋白表达具有变异性；为实现VDC597等靶向抑制剂在犬B细胞淋巴瘤中的潜在有效应用，仍需进一步研究通路活性的适用性与意义。