《Biotechnology for the Environment》：Soil microbiota of industrial hemp (Cannabis sativa L.) grown in a long-term monoculture
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单作（monoculture）被定义为在同一土壤中连续种植单一作物，是一种普遍存在的农业实践，对土壤微生物群落具有重要影响，而土壤微生物群落会影响养分可利用性（nutrient availability）和植物健康。在本研究中，研究人员探究了乌克兰长期工业大麻
单作（monoculture）被定义为在同一土壤中连续种植单一作物，是一种普遍存在的农业实践，对土壤微生物群落具有重要影响，而土壤微生物群落会影响养分可利用性（nutrient availability）和植物健康。在本研究中，研究人员探究了乌克兰长期工业大麻单作对土壤微生物组成和多样性的影响，比较了施肥和非施肥条件下的差异。研究人员使用附近不同种植制度（cropping system）的田块作为参照。微生物群落组成在不同处理间存在差异，与长期单作条件相关的细菌和真菌集合群（assemblages）均发生偏移。非施肥土壤表现出独特的群落特征，这与养分限制条件下的长期选择相一致。值得注意的是，门（phylum）Verrucomicrobia的成员以及Mortierellomycota门内的真菌在非施肥土壤中更为丰富。相比之下，施肥地块中Bradyrhizobium属和Pseudomonas属等类群相对丰度更高，这些类群在其他系统中与养分循环相关。与附近不同种植制度田块相比，微生物群落结构存在明显差异；然而，这些差异可能反映了作物类型、管理历史和土壤遗留条件（legacy soil conditions）的联合效应，而非单作本身。此外，一些包含已报道植物病原菌（plant pathogen）物种的属（例如Acremonium、Neocamarosporium和Pyrenochaeta）在单作地块中更为丰富，尽管分类学分辨率不足以对致病性做出确定性分类推断。由于采样仅在冬季的单一时间点进行，研究结果仅代表土壤微生物群落的季节性评估，需在实测土壤理化性质（physicochemical properties）的背景下进行解释。据研究人员所知，本研究首次对维持90年以上的大麻单作系统中的土壤微生物群落进行了长期特征描述。
本研究聚焦于长期单作农业系统中土壤微生物群落的结构特征与适应性响应，为理解植物-微生物互作及可持续农业管理提供了重要见解。研究背景方面，土壤是地球微生物多样性最大的储存库，土壤微生物群落在植物生理学中扮演关键角色，常被称为植物的"第二基因组"。土壤微生物通过与植物根系的相互作用，提供包括固氮、促进养分吸收、支持种子萌发、幼苗建植、植物激素生产、通过竞争排斥保护植物免受病原菌侵害、合成抗菌化合物以及启动植物防御机制等多种有益功能。然而，单作这一在20世纪随农业技术进步而广泛采用的种植制度，却可能带来土壤退化和作物歉收风险增加等负面效应。单作降低了生物多样性，破坏了生态平衡，增加了病虫害易感性，同时也给植物带来了胁迫。尽管存在诸多弊端，单作仍因其经济效益和高产潜力而被广泛用于水稻、大豆、玉米、小麦等主要粮食作物以及咖啡、茶叶、棉花、甘蔗或甜菜等高价值经济作物的种植。为维持单作系统的生产力，常依赖化肥、除草剂和农药等化学投入，但这些化学物质可能对植物微生物组、环境和整体生物多样性造成损害。已有研究指出，单作对植物根系产生负面影响，根分泌物促进病原菌积累，同时降低根际有益微生物的丰度，而根际微生物在疾病抗性和植物健康中具有关键作用。值得注意的是，某些作物的单作实践可延续数十年之久，如咖啡单作可达57年，波兰华沙生命科学大学的斯凯尔涅维采试验站已连续90年种植黑麦和马铃薯单作，乌克兰波尔塔瓦地区的Staryi Khutir试验地自1884年起不间断种植冬黑麦单作，德国哈雷大学的"永恒黑麦"实验更是持续了超过147年。这些长期试验表明，单作对土壤生态系统的深远影响亟待深入研究。
在此背景下，研究人员提出假设：单作条件下的植物会与特定土壤细菌和真菌形成独特关联，构建出专门化的微生物组，这可能反映了群落层面对单作胁迫的长期适应。基于此，研究人员选取了乌克兰Hlukhiv市麻类作物研究所（Institute of Bast Crops, IBC）自1931年起建立的工业大麻单作试验地进行研究。工业大麻（Cannabis sativa L.）在乌克兰等国传统上具有重要经济价值，因其在纤维、纤维素、种子、油脂以及大麻二酚（cannabidiol, CBD）等生物活性化合物生产中的多元应用而重新受到关注。该研究所拥有通过自主育种项目培育的丰富工业大麻品种资源，部分品种如USO-31已在全球广泛用于纤维、种子和油脂生产。该长期大麻单作试验包含多种施肥处理，以不施肥处理作为对照。研究人员于2024年2月，即植物冬季休眠期采集土壤样品，提取总DNA并进行二代测序（next generation sequencing）及分类学元分析（metataxonomics analysis），以期增进对植物-微生物组互作的理解，并为设计未来农业策略，特别是单作或其他胁迫条件（如土壤贫瘠、养分耗竭、水分匮乏或盐度过高）下作物的种植管理提供有价值的见解。该论文发表于《Biotechnology for the Environment》。
在技术方法层面，研究人员主要采用了以下关键技术：基于Ion Torrent PGM平台的16S rRNA基因V4可变区及ITS（internal transcribed spacer）区域扩增子测序技术，结合UPARSE聚类流程（97%相似度阈值）进行OTU（operational taxonomic unit）聚类和SILVA数据库注释；利用DESeq2进行差异丰度分析；通过MicrobiomeAnalyst平台进行微生物群落组成和多样性的可视化与统计分析；以及基于Bray-Curtis距离的主坐标分析（PCoA）和PERMANOVA统计检验进行beta多样性评估。样本来源于乌克兰苏梅地区Hlukhiv附近的麻类作物研究所长期试验地，包括四个处理：T1（前季种植荞麦的非大麻参照田）、T2（不施肥大麻单作）、T3（矿物肥N??P??K??加20吨/公顷厩肥的大麻单作）和T4（矿物肥N???P politics体系下的K??的大麻单作），各处理采土壤样品。
研究结果部分呈现如下：
**细菌和真菌多样性分析结果显示**，通过alpha多样性（Shannon指数）和beta多样性（PCoA分析）评估发现，细菌群落中T1、T2、T3样品的Shannon指数相似，而T4显著降低；真菌群落各处理alpha多样性较为一致，但施肥单作土壤（T3和T4）指数较低。PCoA分析表明，细菌beta多样性的前两个主坐标解释了69.3%的总变异，PERMANOVA分析显示F值为8.4648，R2为0.61347，p值为0.001；真菌beta多样性的前两个主坐标解释了60.6%的变异，PERMANOVA分析显示F值为6.7524，R2为0.55871，p值为0.001。T2处理的聚类更为紧密，表明其beta多样性较低，微生物组成更为均一。
**微生物丰度谱分析结果显示**，在门水平，细菌共鉴定出29个门，变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）和放线菌门（Actinobacteria）为最优势类群，奇古菌门（Thaumarchaeota）为最主要古菌门。Verrucomicrobia在T2中相对丰度显著增加。真菌共鉴定出14个门，约15%的reads未能鉴定，子囊菌门（Ascomycota）为最优势门，在施肥土壤中丰度更高；被孢霉门（Mortierellomycota）在不施肥单作T2中显著增加。
**门水平差异丰度分析结果显示**，T2与T1比较，8个细菌门存在显著差异，其中Firmicutes和Tenericutes在T2中富集，WPS-2等6个门在T1中富集；5个真菌门存在显著差异，Mucoromycota、Basidiomycota和Rozellomycota在T1中富集，Mortierellomycota在T2中富集。T2与T4比较，17个细菌门存在显著差异。
**属水平群落分析结果显示**，热图分析揭示各处理具有不同的细菌属富集模式。T2中Skermanella、Candidatus Udaeobacter、RB41、mle1-7、Nitrospira、Bacillus、Methylocella、Arthrobacter、Solirubrobacter、Adhaeribacter和Rhodoplanes等属丰度增加。T3中富集的属包括Turicibacter、Romboutsia、Clostridium sensu stricto 1、Terrabacter、Actinoallomurus、Nocardioides、NMD1、Janibacter、Nitrosospira、Devosia、Frigoribacterium、Reyranella、Mesorhizobium、Kribbella、Parasegetibacter、Noviherbaspirillum、Pseudarthrobacter、Hydrogenispora、Variovorax、Pseudomonas和Flavisolibacter等。T4中富集的属包括uncultured Alphaproteobacterium、Acidibacter、Crossiella、Jatrophilapitans、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia、Rhodanobacter、Candidatus Koribacter、uncultured Acidobacteria、Bradyrhizobium、Conexibacter、Granulicella、Acidicaldus、K等国际学术界关注的Ktedonobacter、Actinospica、uncultured Chloroflexi bacterium、Geodermatophilus、Dyella、Mycobacterium、uncultured Planctomycete、Sphingomonas、Streptomyces、Singulisphaera和Blastococcus等。
真菌属水平分析显示，Phomatodes、Macroventuria、Capronia、Acremonium和Arthrinium等属在大麻相关土壤中更为丰富，而T1中具有更广泛多样的真菌属组合。T2中Neocamarosporium、Pyrenochaeta、Mortierella、Coprinopsis和Sebacina等属相对丰度较高；T3中Chrysosporium、Trichophyton、Wallemia、Cordyceps和Trichosporon等属富集；T4中Cortinarius、Cladophialophora、Humicola、Mycosphaerella和Colletotrichum等属富集。潜在致病真菌属数量T2略低于T3和T4，但T3中具有最高比例的此类属（22.9%）。
**讨论与总结部分**，研究人员指出，土壤微生物群落结构和多样性对土地利用变化和管理措施敏感，生物多样性的降低和群落组成的同质化是严重影响生态系统过程完整性和功能的关键因素。本研究在冬季近冰冻条件下采样，所得微生物群落应解读为季节性基线或遗留微生物组，而非活跃的根际过程或正在进行的植物-微生物互作。由于缺乏完全匹配的长期非大麻对照，观察到的差异应理解为反映作物类型、管理历史和遗留效应的系统水平对比，而非仅由大麻单作导致。
Verrucomicrobia在T2中的增加值得关注，该门为自由生活的革兰氏阴性菌，具有广泛的代谢能力和生态多功能性，参与有机碳矿化、氮循环等关键生态系统功能，产生胞外多糖促进土壤团聚体形成，可能作为特定环境条件或人为干扰的指示生物。但需注意，近期研究显示该门成员在杉木单栽人工林中对碳氮循环产生负面影响，因此解释需谨慎。
Firmicutes（亦称Bacillota）在不施肥单作中仍保持显著存在，其中Bacillus和Lysinibacillus等属为众所周知的植物促生菌，具有环境适应性强、能产生生物活性化合物刺激植物生长并保护植物免受病原菌侵害的特点，在养分限制条件下尤为重要。这些细菌形成内生孢子的能力使其适合微生物产品开发，在可持续农业中具有应用潜力。
Mortierellomycota在T2中的富集与其适应寒冷环境的特性相符，该门真菌在有机质分解和养分循环中具有重要作用，部分种类能与植物形成菌根样关联促进养分吸收，还能合成花生四烯酸等高价值脂质。Mortierella alpina和Mortierella exigua在T2中的富集反映了其在长期胁迫和养分限制条件下的生态相关性。
Ascomycota在单作土壤中的增加确认了其生态多功能性，该门包含许多病原菌代表。Acremonium属在T2中丰度增加，可能在有机质分解和植物胁迫适应中发挥作用。Neocamarosporium属的存在尤为引人关注，该属物种通常耐盐，能在高盐胁迫条件下存活，部分种类如N. goegapense具有促进作物耐盐耐旱的潜力，可能在大麻长期单作的胁迫适应性方面具有复杂作用。Pyrenochaeta属的部分物种则是重要的植物病原菌，能分泌水解酶降解植物根细胞壁结构成分，在长期耗竭性管理的土壤中可能 favored。
研究结论指出，这些发现反映的是冬季条件下的微生物群落模式，不代表活跃的植物-微生物互作。与荞麦轮作系统相比，工业大麻单作显著改变了土壤微生物多样性，矿物肥和厩肥的使用进一步影响了土壤微生物组的结构。单作地块alpha多样性降低，而beta多样性在非大麻对照与大麻单作土壤之间、以及不同单作处理之间均存在显著差异。特别是，不施肥单作土壤（T2）表现出更高的细菌门Verrucomicrobia和真菌门Mortierellomycota的相对丰度。这些发现共同表明，土壤微生物组的细菌和真菌组分均适应了长期单作所带来的胁迫条件，这种适应性可能反映了与长期单作条件相关的微生物群落模式，尤其在缺乏肥料的情况下，表明这些微生物组在维持作物应对挑战性条件方面发挥着重要作用。
