热处理鹌鹑胚胎中用于qPCR的组织特异性参考基因稳定性

《Biological Research》：Tissue-specific reference gene stability for qPCR in thermally conditioned quail embryos

　　

摘要

通过定量实时PCR技术对转录本进行相对定量分析的可靠性与准确性，取决于是否使用稳定的参考基因作为标准化依据。然而，不同参考基因在各种组织以及病理生理状态下的表达稳定性可能存在差异。本研究探讨了在日本鹌鹑（Coturnix japonica）胚胎经历胚胎热处理（ETC）后，多种候选参考基因的稳定性。共200枚受精鹌鹑蛋在标准条件下孵化，在胚胎发育的第6–8天和12–14天，每天将鸡蛋置于39.5℃的环境中处理10小时，同时保持湿度在55%不变。从每组中随机选取4个胚胎用于实验。研究了在ETC条件下，8种候选参考基因，即18 S rRNA、β-ACTIN、28 S rRNA、HPRT1、GAPDH、PGK1、RPS8和在肝脏、肠道、大脑和心脏这四种组织中的表达水平。采用五种不同的算法来评估基因表达的稳定性：geNorm、NormFinder、BestKeeper、Delta Ct以及RefFinder（综合基因稳定性评估）。结果显示，不同组织及算法下基因稳定性存在差异。在肝脏组织中，HPRT1、GAPDH和是qPCR分析中最稳定的参考基因，适合作为内参；在肠道组织中，PGK1、RPS8和HPRT1的表达稳定性较高。而在心脏组织中，TBP和HPRT1是被认为最适合作为标准化参考基因的基因，大脑组织中则HPRT1和GAPDH最为稳定。综合考虑所有组织（肝脏、肠道、大脑和心脏），TBP和RPS8是最适合用作标准化参考的基因组合。本研究为选择适宜的参考基因以在热处理条件下的鹌鹑胚胎中进行相对表达定量分析提供了重要依据，有助于提高鸟类发育及应激生理学研究中方量实时PCR数据的可靠性与准确性。