高危人乳头瘤病毒(high-risk HPV) E6及E6/E7癌蛋白引起鳞状上皮组织脂质重编程(Lipid Reprogramming)

《Metabolomics》：Lipid reprogramming of stratified squamous epithelium by the high-risk HPV E6 and E6/E7 oncoproteins

　　

摘要：高危人乳头瘤病毒(high-risk human papillomavirus, hrHPV)持续感染并整合基因组、高表达病毒E6/E7癌基因是宫颈癌的主要病因。新证据表明HPV可重编程宿主代谢以支持病毒持续感染和细胞转化，但HPV癌基因诱导的全谱脂质组学重编程(lipidomic reprogramming)仍不清楚，尤其在HPV诱导转化的早期阶段。研究人员旨在明确表达HPV16 E6单独或联合E7的转基因小鼠鳞状上皮中脂质代谢的调节规律。采用非靶向脂质组学(untargeted lipidomics)鉴定K14E6和K14E6/E7转基因小鼠皮肤及雌性生殖道(female reproductive tract, FRT)相较于野生型(wild-type, WT)小鼠的新脂质生物标志物；应用Lipid Network Explorer(LINEX2)通过脂质富集分析(lipid enrichment analysis)探究HPV癌基因表达对脂质酶的失调影响；使用Global Natural Product Social Molecular Networking(GNPS)平台增强脂质鉴定，借助分子网络(molecular networking)改善特征注释。脂质组学分析显示：①E6表达一致改变甘油磷脂(glycerophospholipid)，皮肤中磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine, PC)→溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine, LPC)途径底物-产物偏移显著；②E6/E7表达导致葡萄糖神经酰胺(glucosylceramide, GlcCer)生物合成失调；③E6/E7表达的皮肤和FRT组织均存在氧化还原失衡及氧化脂质(oxidized lipids)——包括氧脂素(oxylipins)和多种氧化PC——水平升高。结果表明HPV癌蛋白驱动脂质重编程，可能参与HPV相关肿瘤发生早期过程。上述发现为HPV诱导的脂质重编程提供了新认识，并为后续探讨HPV相关癌症中脂质改变的功能与临床意义奠定基础。

论文解读：高危人乳头瘤病毒(high-risk HPV) E6及E6/E7癌蛋白引起鳞状上皮组织脂质重编程(Lipid Reprogramming)

研究背景

高危人乳头瘤病毒(high-risk human papillomavirus, hrHPV)感染及其基因组整合后持续高表达病毒E6与E7癌蛋白(oncoproteins)是宫颈癌及部分头颈部、其他肛门生殖器恶性肿瘤的主要病因。E6通过促进p53降解、E7通过结合并降解视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma protein, Rb)家族成员来驱动细胞周期失控与恶性转化。近年研究证实代谢重编程(metabolic reprogramming)——尤其是脂质代谢重编程——是肿瘤标志之一，PI3K/AKT/mTOR等通路亦参与hrHPV致癌过程，且临床样本已发现宫颈阴道分泌物中某些脂质改变与HPV感染及病变程度相关。然而，hrHPV癌蛋白如何在上皮组织中全局性调控脂质代谢(lipid metabolism)，特别是癌变前早期阶段的系统性脂质组学(lipidomics)变化尚缺乏全面了解，相关酶学失调机制不明。本研究利用已在HPV致癌研究中广泛使用的K14E6及K14E6/E7转基因小鼠模型，在其未发生高级别异型增生或癌前阶段采集皮肤（耳部）与雌性生殖道(female reproductive tract, FRT)组织，通过非靶向脂质组学联合网络生物学分析揭示HPV16 E6及E6/E7对宿主上皮脂质代谢的重编程作用。该论文发表于《Metabolomics》。

主要关键技术方法

研究人员使用FVB/N背景的K14E6（仅表达HPV16 E6）和K14E6/E7（共表达HPV16 E6与E7）转基因小鼠及同背景野生型(wild-type, WT)对照，取耳皮肤与FRT组织进行非靶向脂质组学检测（UHPLC-HRMS正负离子双模式，内标质控）；原始数据经Progenesis QI软件解卷积、峰对齐及初步归一化（按组织重量及总离子强度），结合自建脂质库、LIPID MAPS及HMDB数据库进行脂质注释（Metabolomics Standards Initiative Level 2–3）；进一步将MS数据导入Global Natural Product Social Molecular Networking(GNPS)平台构建分子网络(molecular networking)以通过碎片相似性推断结构相似的新脂质；使用Lipid Network Explorer(LINEX²)基于Reactome与Rhea数据库重建脂质-反应网络并进行脂质集富集分析(lipid set enrichment analysis, LSEA)及酶失调推断；统计上采用差异倍数(fold change)>2结合Benjamini–Hochberg校正FDR<0.05（皮肤）或未校正p≤0.05（FRT因异质性大），LSEA用R包lipidr与mdgsa计算对数优势比(log odds ratio, LOR)。

研究结果

3.1 Lipidomics profiling of cutaneous tissues from HPV16 transgenic mice

对K14E6、K14E6/E7及WT小鼠耳皮肤脂质组学分析检出逾1000种脂质分子。E6与E6/E7组整体趋势为溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine, LPC)、磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine, PC)及氧化脂肪酸(oxidized fatty acids, OxFA)富集，甘油三酯(triglyceride, TG)与神经酰胺(ceramide, Cer)多数降低；主成分分析(principal component analysis, PCA)显示HPV阳性与WT组织脂质谱明显分离；LSEA提示OxFA显著富集，中性甘油脂与数类鞘脂（TG、Cer-ADS、Cer-NDS、鞘磷脂sphingomyelin, SM）显著减少，其中E6/E7皮肤中葡萄糖神经酰胺(glucosylceramide, GlcCer)与心磷脂(cardiolipin, CL)显著下调，LPC与PC亚类上调。差异分析发现E6组80种、E6/E7组253种脂质显著差异变化(FDR≤0.05, FC>2)，且E6引起的变化几乎全部被E6/E7重现(79/80)，表明E6是主要驱动因素；E6/E7 vs E6直接比较提示E7特异性贡献包括胆固醇酯(cholesterol ester, CE)升高、CL/GlcCer/神经节苷脂(ganglioside)/SM降低。GlcCer(d18:2/20:0)经MS/MS确认在两种转基因皮肤中显著下调。

3.2 Lipidomics profiling of mucosal tissues from HPV16 oncogene expressing mice

FRT组织脂质子类改变少于皮肤，PCA未显示明显分组分离。LSEA示TG与二酰甘油(diacylglycerol, DG)减少，CE增加；醚键连接的LPC与PC在E6/E7组富集；Cer-AS亚型在E6/E7中显著减少。差异分析(E6 vs WT: 21种; E6/E7 vs WT: 28种显著变化, 未校正p≤0.05, FC>2)及E6/E7 vs E6比较提示E7使磷脂类在FRT中上调。GlcCer(d18:2/20:0)在FRT中也呈下调趋势但未达显著性(p<0.10)。

3.3 Improved annotation of novel lipids by molecular networking

在Progenesis QI初筛基础上，通过GNPS分子网络构建鞘脂（Cer与羟基Cer、GlcCer）、LPC/OxPC及氧脂素(oxylipin)子网络。利用已知节点MS/MS谱图相似性与质量差推断出多个Cer、GlcCer及LPC(含氧化LPC(22:2;O₂))的结构归属；建立含HETE、DiHETE、EpDTA、EpDPA、HDTA等氧脂素的子网络，证实其在E6/E7皮肤及FRT中总体升高（注释至MSI Level 3，因无法区分同分异构体）。分子网络显著提升了新脂质特征注释覆盖率与准确度。

3.4 Network LINEX²analysis reveals lipid enzyme dysregulation

LINEX²重建全局脂质反应网络并筛选最显著底物-产物变化子网络。皮肤中E6 vs WT最显著子网络为PC?LPC互变（涉及磷脂酶A₂(phospholipase A₂, PLA₂)与溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶(lysophosphatidylcholine acyltransferase, LCAT)），表现为LPC(18:2)上调其余LPC下调、多数对应PC上调而PC(18:2_20:0)下调，提示PLA₂/LCAT活性失调由E6驱动；E6/E7 vs WT最显著子网络为GlcCer生物合成（UDP-葡萄糖神经酰胺葡糖基转移酶(UDP-glucose ceramide glucosyltransferase, UGCG/GBA无歧义指UGCG即GlcCer synthase)催化Cer→GlcCer），网络中4/5 GlcCer下调而对应Cer上调（除GlcCer(d18:1/16:0(OH))），提示UGCG或其反向酶葡糖脑苷脂酶(glucocerebrosidase, GCase)受E6/E7调控。FRT中最显著子网络为二酰甘油(diacylglycerol, DAG)→三酰甘油(triacylglycerol, TAG)代谢（涉及含patatin样磷脂酶结构域蛋白(patatin-like phospholipase domain-containing protein, PNPLA)家族的TAG水解酶），TAG总体下降、部分DAG上升，提示甘油脂质代谢与脂滴动态受hrHPV调控，E6为主要驱动。LION(Lipid Ontology)富集分别给出皮肤E6关联"glycerophosphocholine"与"positive/zwitter-ion headgroup"，E6/E7关联"d18:1 sphingosine"与"C22:0 saturated FA"；FRT关联"glycerolipid""neutral headgroup""lipid storage""lipid droplet"。

讨论与结论总结

讨论指出本研究首次在HPV癌蛋白表达但尚未形成高级别病变的体内模型中系统描绘脂质重编程，整合Progenesis QI与GNPS分子网络改善了鞘脂及氧化脂质注释。E6单独即可引起PC/LPC途径酶(PLA₂, LCAT)失调及氧化脂质升高；E6/E7共表达额外导致GlcCer合成酶(UGCG)相关糖苷鞘脂代谢改变及更强氧化应激迹象，推断E7贡献为磷脂进一步重塑、CE升高伴CL/GlcCer/GM3等 glycosphingolipid下调（需E7单转基因模型验证）。氧化脂质(oxylipins)升高为假设生成性发现，其确切酶源与功能待靶向验证。局限性含样本量偏小、网络工具尚未完全自动化、雌雄混合皮肤样本未做性别分层。结论：HPV16 E6及E6/E7癌蛋白驱动鳞状上皮组织特异性脂质重编程——E6主要扰乱甘油磷脂(PC?LPC)重塑与引发氧化应激，E6/E7共同导致葡萄糖神经酰胺(GlcCer)生物合成失调及氧化脂质累积——为理解HPV相关肿瘤发生早期代谢改变提供新框架，所识别的差异脂质及推定酶靶点(PLA₂/LCAT、UGCG)可作为HPV相关癌症脂质生物标志物与代谢干预方向的探索基础。