基于诊断离子与分子网络技术对油千里光中三种新型抗增殖莽草酸衍生物及已知吡咯里西啶生物碱的表征

《Metabolomics》：Characterization of three new antiproliferative shikimic acid derivatives and known pyrrolizidine alkaloids from Senecio oleosus guided by diagnostic ions and molecular networking

　　

摘要：千里光属包含超过1,200个物种，其中至少有25个因含有吡咯里西啶生物碱（PAs）而具有毒性。在巴西，大约有68个物种，主要分布在农村和山区。本研究旨在利用分离和去重复策略研究油千里光的专化代谢物，并评估其对肿瘤细胞系的抗增殖活性。研究人员对油千里光进行了植物化学研究，采用了多种色谱技术。结构解析基于光谱分析以及与文献数据的比较。去重复分析使用超高效液相色谱-高分辨质谱联用技术（UHPLC-HRMS/MS）进行。分子网络通过全球天然产物社会分子网络平台（GNPS2）生成，并使用Cytoscape进行分析。抗增殖活性通过MTT法进行评估。研究成功分离出三种新的酯化莽草酸衍生物。吡咯里西啶生物碱的去重复由诊断碎片离子m/z 120和m/z 138引导。酯化莽草酸衍生物的诊断离子是基于分离化合物在MS/MS谱中观察到的裂解模式建立的。分子网络分析实现了对另外36种推定酯化莽草酸衍生物的注释。其中一种三酯化莽草酸衍生物对HCT-116细胞系显示出有前景的抗增殖活性，其IC₅₀值为10.5 μg·mL^?1（20.2 μM）。总而言之，在油千里光中总共鉴定出82种化合物。除了N-氧化物倒千里光碱（N-oxide retrorsine）和N-氧化物千里光碱（N-oxide senecionine）外，所有化合物均为首次在该物种中报道。酯化莽草酸衍生物成为油千里光中主要的专化代谢物类别，并且三酯化衍生物显示出有前景的抗增殖活性。

**论文解读：油千里光中新型莽草酸酯衍生物与吡咯里西啶生物碱的系统表征与抗增殖活性研究**

**研究背景与意义**
千里光属是菊科中最大的属之一，全球分布超过1200种，其中至少25种因含有吡咯里西啶生物碱而具有毒性，对人和牲畜构成潜在健康风险。在巴西，该属约有68个物种。除PAs外，该属植物也常报道含有艾里莫芬烷型和呋喃艾里莫芬烷型倍半萜。相比之下，酯化莽草酸衍生物则被认为是罕见的分类学标记，迄今为止仅在8种千里光属植物中被鉴定。油千里光是巴西本土物种，其化学成分与药理活性此前研究有限。植物提取物中PAs和莽草酸衍生物的结构复杂性及其同分异构体的共存，对传统的植物化学分离构成了重大分析挑战。液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）与现代非靶向代谢组学工具的结合，已成为加速去重复和代谢物注释的强大方法。PAs可根据其特征裂解模式在复杂混合物中进行有效表征，例如，产物离子m/z 120和m/z 138是公认的不饱和PAs诊断标记。然而，系统化这些罕见莽草酸酯的MS/MS行为对于支持其在复杂混合物中的高通量鉴定至关重要。同时，寻找具有细胞毒性的新天然产物仍是药物发现的关键驱动力，研究人员对油千里光的研究旨在填补其化学与药理活性数据的空白，并探索其抗肿瘤潜力。本研究发表在《Metabolomics》期刊上。

**关键技术方法**
本研究采用了一系列现代分析化学与生物学技术。首先，通过多种色谱技术（硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶层析）对采自巴西巴拉那州庞塔格罗萨的油千里光地上部分乙醇提取物进行系统分离。其次，利用核磁共振波谱（NMR，包括1H、13C、COSY、HMBC、HSQC）对分离得到的单体化合物进行结构解析与确证。代谢物分析的核心是超高效液相色谱-高分辨串联质谱（UHPLC-HRMS/MS），用于对粗提物及各极性部位进行全面的代谢物谱分析。基于质谱数据的分子网络分析通过GNPS2平台实现，并使用Cytoscape软件进行可视化，该策略用于代谢物的去重复与注释。最后，采用MTT法评估样品对三种肿瘤细胞系（HCT-116结肠癌、501mel转移性黑色素瘤、MCF-7乳腺癌）的抗增殖活性，并通过SwissADME在线平台对分离化合物的理论理化性质进行预测分析。

**研究结果**
**3.1 化合物的分离与结构解析**
研究人员从油千里光地上部分粗提物中分离得到6个化合物，包括3个新的莽草酸衍生物（**1**、**2**、**3**）和3个已知化合物：N-氧化物倒千里光碱（**4**）、槲皮素（**5**）和3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸（**6**）。通过HR-ESIMS、1D/2D NMR等光谱数据，确定了新化合物的结构。化合物**1**被鉴定为3α,5β-二千里光酰氧基-4α-十二烷酰氧基莽草酸，是一种三酯化莽草酸衍生物。化合物**2**和**3**为混合物，分别被推定为3α-千里光酰氧基-4α-十二烷酰氧基莽草酸（二酯化，C-5位游离羟基）和3α,5β-二千里光酰氧基莽草酸（二酯化，C-4位游离羟基）。这些新代谢物扩展了千里光属中已知的莽草酸酯类结构多样性，其特征是同时结合了脂肪酰基链和千里光酰基团。

**3.2 吡咯里西啶生物碱的去重复分析**
研究人员在正离子模式下构建了包含436个前体离子的分子网络。以分离得到的N-氧化物倒千里光碱（**4**）为参考标准，利用其诊断碎片离子m/z 120和m/z 138，通过GNPS2平台的MS2 m/z高亮工具，从网络中筛选出17个节点，其中7个（MS-1至MS-7）被推定为PAs。未检测到饱和retronecine型或otonecine型PAs的特征碎片离子，表明分析部位中可能不存在这些特定PA亚型。

**3.3 莽草酸衍生物的去重复分析**
在负离子模式下，研究人员构建了包含268个前体离子的分子网络。以分离化合物**1**-**3**的MS/MS谱图作为内部参考标准，建立了酯化莽草酸衍生物的诊断裂解模式。对于三酯化衍生物（如**1**），其特征碎片包括m/z 319（失去C-4位连接的脂肪酸）、m/z 275（进一步失去CO₂）、基峰m/z 199（C-4位脂肪酸的羧酸根阴离子）以及m/z 99（千里光酰氧基）。对于二酯化衍生物（**2**和**3**），基峰为m/z 93。基于这些诊断离子，研究人员对分子网络进行了详细检查，在一个高度连接的簇中识别出多个节点。通过应用诊断离子逻辑（Mdi1, Mdi2, Mdi3），研究人员共推定了36个新的酯化莽草酸衍生物，包括15个三酯化衍生物（MS-17至MS-31）、9个二酯化衍生物（MS-32至MS-42）和3个单酯化衍生物（MS-43至MS-45）。

**3.4 其他专化代谢物的去重复分析**
分子网络方法还注释了其他化学类别的多种代谢物，包括黄酮类（18个，MS-46至MS-63，其中6个为甲氧基化黄酮）、奎宁酸衍生物（6个，MS-64至MS-69）、脂肪酸（4个，MS-70至MS-73）、糖类（6个，MS-74至MS-79）以及其他类别的3个化合物（MS-80至MS-82）。值得注意的是，推定了橙酮（aurone, MS-57）的存在，这与油千里光开黄花的形态特征相符；此外还注释了倍半萜pechueloic acid（MS-80）。

**3.5 抗增殖活性测定**
这是首次研究来自巴西南部开阔田野植物地理区域的油千里光的抗增殖潜力。MTT法初步筛选显示，粗提物（SCE）、正己烷部位（SHE）和二氯甲烷部位（SDC）具有较高的细胞毒潜力，其中SDC部位对HCT-116细胞的抑制率在50 μg·mL^?1时达98.6%。化合物**1**在50 μg·mL^?1和5 μg·mL^-1浓度下对HCT-116细胞的抑制率分别为99.6%和80.8%。剂量反应实验表明，化合物**1**对三种测试细胞系均显示出有前景的活性，其IC₅₀值分别为：HCT-116细胞10.5 μg·mL^?1（20.2 μM）、501mel细胞13.3 μg·mL^?1（25.6 μM）、MCF-7细胞11.5 μg·mL^?1（22.1 μM）。根据美国国家癌症研究所的标准，IC₅₀值<20 μg·mL^?1被认为具有高抗增殖活性。SwissADME理论分析显示，化合物**1**具有最高的脂溶性（LogP = 5.78）和最低的预测水溶性（LogS = ?6.89），其增强的疏水性可能有利于被动膜扩散和细胞内积累，从而有助于其优越的抗增殖活性。这是首次报道酯化莽草酸衍生物的抗增殖活性。

**讨论与结论**
本研究首次全面表征了油千里光的专化代谢组。三种新的酯化莽草酸衍生物的分离，结合MS/MS裂解研究，使得研究人员能够阐明一致的裂解途径并提出诊断离子。这些分子标记对于靶向去重复和注释该类代谢物的结构相关化合物至关重要。此外，目前的研究结果凸显了三酯化莽草酸衍生物作为开发新型抗癌剂的有前景的支架潜力，并为合理设计和合成具有改善生物活性的新类似物提供了基础。总而言之，在油千里光中总共鉴定出82种化合物。除了N-氧化物倒千里光碱和N-氧化物千里光碱外，所有化合物均为首次在该物种中报道。酯化莽草酸衍生物成为油千里光中主要的专化代谢物类别，并且三酯化衍生物显示出有前景的抗增殖活性。