《Veterinary Research》：Unveiling the clinical signs and pathology in red deer (Cervus elaphus) naturally infected with epizootic haemorrhagic disease virus serotype 8
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流行性出血病（Epidemic Haemorrhagic Disease, EHD）是由反刍动物环状病毒（Orbivirus ruminantium, EHDV）引起的一种须向世界动物卫生组织（World Organisation for Animal Hea
流行性出血病（Epidemic Haemorrhagic Disease, EHD）是由反刍动物环状病毒（Orbivirus ruminantium, EHDV）引起的一种须向世界动物卫生组织（World Organisation for Animal Health, WOAH）通报的疾病，该病毒与蓝舌病病毒（Bluetongue Virus, BTV）密切相关，经库蠓属（Culicoides spp.）昆虫媒介传播。2022年秋季，EHDV血清型8型（EHDV-8）首次在西班牙及欧洲被检测到，感染家养及野生反刍动物。赤鹿（Cervus elaphus）为受感染最严重的野生物种，报道出现神经症状、严重呼吸窘迫及死亡。然而，EHDV-8在该物种中的发病机制仍知之甚少。该研究旨在评估EHD对赤鹿的临床与病理学影响，表征临床症状、主要病变、EHDV的组织分布及靶细胞。研究人员通过全国性在线调查和现场疫情研究收集临床数据，并对16例确诊EHDV-8病例进行组织病理学和免疫组织化学分析。常见临床症状包括神经症状、流涎、跛行和呼吸困难。疫情暴发期间，圈养赤鹿的平均发病率和死亡率分别为6.9%和4.9%，病死率为70.3%，雄性和成年个体病死率更高。大体检查显示广泛的血管和上皮病变，伴有全身性淤血、局灶至多发性出血及明显肺水肿，组织学证实存在严重细胞损伤。受累最严重的器官为脑、肺、肝、肾和脾，表现为间质性水肿、血管炎、单核细胞浸润伴坏死、严重淋巴组织耗竭及脑内胶质细胞增生伴卫星现象。EHDV抗原主要在巨噬细胞、网状细胞、内皮细胞和上皮细胞中检出。该研究首次描述了EHDV对赤鹿的临床和病理学影响，证实其对EHDV-8的高度易感性。
该研究发表于《Veterinary Research》，旨在揭示EHDV-8感染赤鹿的临床特征与病理机制，为理解该病毒在新发地理区域的宿主适应性及致病性提供重要依据。
研究背景与问题提出方面，EHD是由EHDV引起的、须向WOAH通报的虫媒病毒病，与BTV同属环状病毒科（Sedoreoviridae），经库蠓属（Culicoides spp.）叮咬传播。该病毒最初于1955年在北美白尾鹿（Odocoileus virginianus）中被发现，已知存在7种血清型（1–2和4–8），地理分布异质性显著。EHDV-8于1982年首次在澳大利亚牛群中发现，2021年在突尼斯牛和北非黇鹿（Cervus elaphus barbarus）中引发疫情，但欧洲此前并无EHD报道。2022年11月，意大利及西班牙首次确认EHDV-8疫情，2023年迅速蔓延至伊比利亚半岛全境，并波及葡萄牙和法国。在西班牙，2023年共确认267起EHDV-8疫情，涉及17个自治区中的15个。尽管牛感染后多为自限性轻症，野生反刍动物尤其是赤鹿的致病性似乎更为严重，出现神经症状、共济失调、逃逸本能丧失及出血性病变。2023年7月至12月间，仅向WOAH报告的赤鹿死亡病例即达176例。然而，赤鹿感染EHDV-8的临床表现和病理影响此前完全未知。此外，欧盟第2023/2515号授权条例对活反刍动物跨境移动实施限制，造成重大经济损失。鉴于上述知识空白和实际防控需求，研究人员开展了此项研究。
研究人员采用多种技术方法开展研究，主要包括：全国性匿名在线问卷调查，通过Microsoft Forms?设计22个问题，经10位专家预试后，面向西班牙狩猎场管理者、猎场看守、兽医、猎人及农场主等多渠道 disseminated，收集2023年11月至2024年4月间的临床影响数据；西班牙南部某赤鹿养殖场的现场疫情研究，对1709头赤鹿（933头雄性、776头雌性）进行系统临床观察，记录发病、治疗及死亡情况，并按性别和年龄分层分析；对16头 found dead 的赤鹿（15头成年雄性、1头幼年雄性）进行病理学评估，样本来自安达卢西亚、卡斯蒂利亚-拉曼恰和加泰罗尼亚等地，通过大体病理检查、组织病理学半定量评分（0–4分制）及免疫组织化学分析（针对VP7蛋白的单克隆抗体1B4B6）检测病变；分子生物学确认采用Pan-EHDV RT-qPCR（靶向Seg-9）及EHDV-8特异性RT-qPCR（靶向Seg-2），并以阳性对照和潘-BTV RT-qPCR排除BTV感染；统计学分析采用χ2检验、Poisson检验及Kruskal-Wallis检验等。
研究结果部分呈现如下。
"临床影响评估"显示，全国性调查由48个狩猎场的专业人员完成，涵盖西班牙17个省份，平均面积4613公顷。调查显示EHD病例主要集中在2023年6月至10月，8月达峰，平均疫情持续64天，从发生到高峰34天、到症状消退32天。临床起病多为急性或超急性，神经症状（20.8%–62.5%的病例）和呼吸困难（39.6%）最常见。成年赤鹿临床发病率显著高于幼龄个体（Poisson检验，z=22.88，p<0.001），但调查受访者估计的死亡数雌性高于雄性，可能与雌性偏多的野生种群结构有关。养殖场疫情研究中，1709头赤鹿中118头出现临床症状，总体发病率6.9%，雄性（8.7%）显著高于雌性（4.8%）（χ2=9.50，p=0.002）；总体死亡率4.9%，雄性（6.3%）同样高于雌性（3.1%）（χ2=8.88，p=0.0029）；总病死率70.3%，性别差异无统计学意义。几乎所有病例（99.0%）均为成年个体（>3岁）。部分经抗生素（四环素、青霉素、头孢菌素）和非甾体抗炎药治疗的动物中63.5%（33/52）康复，但存活雌鹿中1头发生致命性难产、10头随后妊娠流产。
"病理学评估"部分，16头赤鹿的大体病变均符合EHD特征，EHDV-8感染经RT-qPCR和/或IHC确认，且全部BTV阴性。常见大体病变包括皮肤和口腔黏膜撕裂、糜烂及浅表伤口，口腔黏膜明显淤血伴牙垫黏膜部分脱落。最突出的发现为全身性血管改变，包括广泛淤血和局灶/多发性出血，肺动脉壁内膜和中膜出血，肺水肿（气道内大量泡沫状液体，肺体积增大、质重湿润，小叶间隔因水肿液增宽），伴广泛瘀点性出血。许多动物未见死后血液凝固，伴血尿、膀胱黏膜瘀点及出血性肠炎。大脑脑膜淤血。4头动物经细菌培养检出产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）α、ε和β2毒素基因阳性。
组织病理学结果显示多器官受累，脑、肺、肾病变最为严重。中枢神经系统：脑为最一致且最严重受累器官，100%（7/7）的动物检出淤血、广泛血管周围水肿、神经元肿胀、大量胶质细胞增生（gliosis）、卫星现象（satellitosis）和神经元坏死，通常达中度严重程度；85.7%（6/7）见淋巴细胞/单核细胞构成的血管周围套（perivascular cuffing）；28.6%见多灶性脱髓鞘区、轴突球状体（axonal spheroids），42.9%见海绵样变性，42.9%见出血。小脑偶见浦肯野细胞坏死。呼吸系统：肺为最一致受累器官之一，100%（15/15）见严重淤血伴间质和肺泡出血，93.3%（14/15）见中度间质性水肿，46.7%（7/15）见轻度肺泡水肿；66.7%（10/15）见轻至中度血管炎伴单核细胞炎性浸润和内皮肿胀；73.3%（11/15）见单核细胞间质浸润提示间质性肺炎；46.7%见坏死灶累及内皮和间质细胞；86.7%（13/15）见气肿，33.3%见肺不张和细支气管上皮脱落。心脏：病变相对较轻较轻且不一致，最常见的为中度血管改变，100%（13/13）见淤血和心肌出血，92.3%（12/13）见血管周围水肿；84.6%（11/13）见单核细胞炎性浸润；46.2%（6/13）见多灶分布的心肌坏死。肝脏：病变频繁且异质性，100%（13/13）见窦状隙淤血，71.4%（9/13）见中至重度门静脉周围淤血；肝实质和门静脉周围分别64.3%和92.9%见中度单核细胞浸润；85.7%（11/13）见小叶中心性肝细胞凝固性坏死，35.7%见小叶中心静脉内皮坏死。淋巴系统：脾62.5%（10/16）见中度淤血，81.3%（13/16）见坏死性改变，100%（16/16）见显著淋巴组织耗竭（lymphoid depletion）；淋巴结同样见血管改变和显著淋巴组织耗竭。肾脏：100%（14/14）见淤血，92.6%（13/14）见出血，髓质较皮质更严重；100%见严重多灶性肾小管变性和中度间质单核细胞炎性浸润，85.7%见肾小管坏死，64.3%见无细胞管型。
病毒组织分布方面，EHDV-8在所有经RT-qPCR分析的动物脾脏中检出，并在4头完整采样动物的肝、肾、心、脑、肺、淋巴结、气管、性腺（卵巢/睾丸）及口鼻部口腔黏膜中确认。免疫组织化学显示病毒抗原主要位于细胞质，呈颗粒状红色染色。病毒抗原主要在淋巴细胞、巨噬细胞、上皮细胞、内皮细胞和网状细胞中检出：脾脏红髓中主要为巨噬细胞及相关细胞；淋巴结皮质和髓质的淋巴细胞和巨噬细胞；肺中间质巨噬细胞、细支气管上皮细胞和肺泡巨噬细胞；肝窦状隙中Kupffer细胞和内皮细胞；口鼻部口腔黏膜炎症浸润中的巨噬细胞和成纤维细胞。脑、肾、心、气管和舌未见免疫阳性。
研究结论部分翻译如下：该研究首次深入分析了EHDV自然感染赤鹿的临床和病理学效应。通过调查、现场疫情研究、大体病理学、组织病理学和免疫组织化学相结合，研究人员表征了临床影响，评估了多器官病变的范围和严重程度，鉴定了病毒靶细胞，并描述了该病的全身性病理效应。这一综合性方法也使得与其他野生和家养反刍动物物种以及不同EHDV血清型的病理学发现进行相对比较成为可能。
调查发现表明EHD在西班牙具有明显季节性，大多数赤鹿病例报告于7月至10月间，与国内主要库蠓媒介的活动高峰一致。疫情平均持续64天，从发生到临床发病率高峰平均间隔34天，这一时间模式与病毒血症和临床症状的密切关系一致，与先前报道的白尾鹿自然和实验感染中约3周的病毒血症持续时间相符。然而，群体水平的较长持续时间与个体动物约3周病毒血症相比，可能反映了实验感染和自然感染动态的对比：实验研究中所有动物通常同时暴露，而自然条件下经库蠓的传播随时间发生，导致更广泛的感染窗口。调查中约32天后疾病消退，这可由约10–14天可检出的中和抗体解释。现场研究证据表明自然EHDV感染刺激暴露动物产生 robust 抗体反应，支持临床康复并降低群体对后续感染的易感性。
赤鹿EHD的临床表现主要为急性或超急性，与西班牙首次确认病例的观察一致，也与北美白尾鹿感染EHDV-1和EHDV-2的急性/超急性病程相符。疾病快速进展有时使死亡前检测困难。赤鹿的发病率6.9%处于牛感染所报道范围的较低水平；死亡率4.9%表明群体水平死亡率中等，但病死率（70.9%）高。这一模式与其他高易感物种鹰种一致，如白尾鹿田间暴发中估计67.0%的病死率。调查结果和农场疫情研究均表明EHD对成年赤鹿的影响大于幼龄个体，与EHDV-2感染白尾鹿的实验研究一致。性别特异性分析显示雄性的死亡率和病死率高于雌性，这种增加的易感性可能由秋季发情季节成年个体经历的严重生理应激和不良体况所促进。然而，全国性调查估计的成年雌鹿死亡数高于成年雄性，这与受影农场发现不一致，可能反映了雌性偏多的野生种群与雄性偏多的养殖系统之间的种群结构差异。
临床表现在不同宿主物种和血清型间存在差异。所有器官检查详细程度相同，但仅在脑、肺和肾识别出器官特异性病变类别，反映了这些组织中组织病理学变化的更大多样性。来自EHDV-8感染养殖赤鹿的数据以及全国性调查的现场报告均突出神经症状为主，逃逸反应丧失和共济失调是赤鹿中最常观察到的表现。病理分析中神经病变同样突出，脑是组织学上最一致受累的器官。胶质细胞增生、卫星现象、神经元变性和非化脓性血管周围套被一致观察到，与EHDV-8在赤鹿中的明显神经嗜性一致，RT-qPCR在全部完整采样动物（4/4）的脑中检出病毒 RNA 进一步证实了这一点。虽然其他EHDV血清型感染的野生反刍动物中也有神经症状和中枢神经系统病变的报道，但这些表现不常见且通常不如本研究及近期EHDV-8报告中观察到的严重。牛中无论何种血清型均未记录到中枢神经系统受累。因此，本研究报道的EHDV-8诱导神经改变的广泛性和严重性值得关注，提示赤鹿可能对EHDV感染表现出增强的神经病理易感性。
呼吸症状如呼吸困难和鼻漏、跛行及黏膜糜烂也在EHDV-8感染赤鹿中被报道。这些临床表现在同血清型感染的牛中明显更严重，后者疾病通常为亚临床或仅限于轻度症状。肺淤血、水肿和气道内泡沫状浆液体的频繁观察强烈提示急性呼吸窘迫是赤鹿的突出临床特征，与感染白尾鹿及Ibaraki病毒（EHDV-2）感染牛中的报道相当。大体和显微检查一致表明，EHDV-8与赤鹿严重全身性疾病相关，特征为广泛血管损伤，包括明显淤血、出血、广泛水肿、炎症和组织坏死，尤以肺部为甚。这些病变与肺中间质巨噬细胞和上皮细胞中EHDV抗原检测的吻合，提示局部病毒复制和免疫激活可能促成内皮损伤和血管渗漏，最终导致该器官出血、水肿和坏死。这些发现与白尾鹿和EHDV-6感染牛的病理表型一致，其中血管完整性破坏是EHD的关键致病机制。此外，心肌肉病变组织学分析揭示心肌淤血和肌间出血伴中度间质单核细胞炎性浸润，符合全身性内皮损伤，与白尾鹿感染EHDV-2和EHDV-6的先前描述一致。观察到的心血管功能障碍联合呼吸损害，在EHDV-8感染赤鹿急性致死结局的病理生理学中起重要作用。
肝脏也表现突出血管和炎性改变，包括窦状隙淤血、出血及部分病例门静脉周围单核细胞浸润。窦状隙淤血此前在白尾鹿和北非黇鹿中报道。值得注意的是观察到多 area 凝固性坏死，提示继发于缺氧和内皮功能障碍的肝细胞损伤。EHDV免疫阳性主要见于Kupffer细胞和内皮细胞，表明这些肝脏病变可能源于病毒直接效应和对内皮功能障碍的反应。脾脏和淋巴结同样可见血管和坏死性病变，伴显著淋巴组织耗竭。这种耗竭可能反映病毒对免疫细胞如巨噬细胞和淋巴细胞的嗜性，并可能指示急性感染期的免疫抑制，导致宿主易感性暂时增加而发生机会性感染。此外，这些细胞中EHDV抗原的检测提示其可能在EHDV-8播散中发挥作用，如BTV感染小反刍动物中所描述的，支持其可能参与全身播散、内皮靶向和相关血管病变的发病机制。
肾脏病理学是另一突出特征，大体可见肾脏脆弱、呈糊样，即使死后立即剖检的动物亦然。组织学上病变包括肾小管变性、肾小管上皮坏死、增生性肾小球肾炎和皮髓质血管损伤。这与白尾鹿和骡鹿中的先前报道一致。血尿在本研究中被描述，此前EHD病例中尚无特异性报道。但EHDV-8感染赤鹿中观察到的严重肾脏和血管病理可能与该研究中描述的血尿发生一致。此外，病毒RNA在2头雄性和2头雌性的性腺组织中检出，提示EHDV可能到达赤鹿的生殖器官。这一发现可能解释EHDV-6和EHDV-8感染牛中报道的繁殖障碍，尽管赤鹿中的相关繁殖后果尚未充分研究。
然而，自然感染动物的使用存在局限，可能引入感染剂量、暴露时间和疾病阶段方面的个体差异。此外，现场剖检缺乏统一性，器官采样类型和数量因动物而异，导致可用于IHC或分子分析的完整组织套数有限。IHC检测EHDV的敏感性限制可能导致病毒抗原分布的低估。具体而言，本研究使用的单克隆抗体此前未经验证用于IHC，其敏感性降低可能归因于抗体亲和力有限、固定过程中抗原丢失、采样时间不佳或组织保存不良等因素，鉴于大多数疫情发生于西班牙南部高温夏季。尽管存在这些局限，临床症状、大体和组织学病变与RT-qPCR和IHC关键组织中病毒抗原检测之间的一致性，提供了EHDV-8诱导病理的有力证据。需要进一步的控制条件下实验研究以阐明病变发展的时间动态、病毒组织嗜性和宿主免疫应答。
总之，该研究首次提供了关于EHDV-8此前未表征宿主中、新发地理和流行病学背景下发病机制的新见解。EHDV-8与赤鹿严重且常为全身性疾病相关，特征为明显神经嗜性、内皮损伤和多器官受累。这与同一流行病学条件下牛中通常较轻的表现形成对比。在自然感染赤鹿中，EHDV-8表现出广泛的组织分布，可能与巨噬细胞和淋巴细胞中病毒检测相关，导致淋巴组织耗竭。但需要进一步实验研究以更好阐明EHDV-8感染赤鹿的发病机制。现场病例结果表明，EHDV-8感染在赤鹿中可能具有中等群体水平影响，但临床受影响个体中严重程度高，存在可能影响疾病检测和临床结局的性别和年龄相关差异。此外，尽管迄今为止西班牙EHD疫情中牛和赤鹿受影响最严重，但监測其他野生有蹄类至关重要，包括狍（Capreolus capreolus）、黇鹿（Dama dama）、欧洲盘羊（Ovis orientalis musimon）和伊比利亚山羊（Capra pyrenaica），因为这些物种同样对EHDV感染易感。理解本土野生生物对新兴环状病毒的易感性和致病性，对于预测未来疫情和指导综合疾病管理及保护策略至关重要。
