放射不透性微球-水凝胶复合物用于大型动物模型中持续释放肿瘤内免疫治疗

《Drug Delivery and Translational Research》：Radiopaque microsphere-hydrogel composite for extended-release intratumoral immunotherapy in a large animal model

　　

肿瘤内注射免疫刺激剂有望逆转免疫抑制性肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME)，但注射药物会迅速冲洗进入体循环，导致全身毒性并降低疗效，可能需要每日注射才能产生抗肿瘤免疫应答。为解决这一问题，研究人员开发了一种缓释水凝胶，可将免疫治疗药物保留在注射部位并在数天内持续释放，即使在高度血管化的肝脏肿瘤中亦可实现。该缓释水凝胶是一种复合材料，包含载药微球（用于持续、可调节的药物释放），嵌入放射不透性交联水凝胶（用于局部滞留）中。利用这些新型肿瘤内药物载体，研究人员证实了将多种不同免疫治疗药物（细胞因子、寡核苷酸、小分子）安全递送至猪肝脏肿瘤的能力，且无急性全身毒性。与微球相比，微球凝胶可将突释释放降低7.8倍；与水凝胶相比，可将半衰期延长>15倍。因此，载有免疫治疗药物的微球凝胶可实现单次注射持续肿瘤内递送免疫刺激剂，且全身毒性较低。

**研究背景与意义**

肝脏相较于其他器官处于免疫抑制状态，这限制了检查点抑制剂在肝转移患者中的疗效。肿瘤内注射免疫刺激剂有望逆转免疫抑制性肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME)，但现有给药方式存在明显局限：注射药物迅速经体循环洗脱，导致全身毒性并降低疗效，需要每日反复注射才能产生有效的抗肿瘤免疫应答。在高度血管化的肝脏肿瘤中，针尖可能部分位于肿瘤内血管内，肿瘤内注射实际上等同于静脉推注给药。此外，重复肿瘤内注射会给患者带来痛苦，并增加出血、针道播散和转移的风险。可注射水凝胶虽可减少药物外渗，但缺乏系统的比较数据以优化水凝胶选择；载药微粒虽可用于肿瘤内注射，但同样存在泄漏问题，且大微粒易堵塞注射针。基于此，研究人员开展了本项研究，旨在设计、评估和优化能够在注射部位保留药物并在数天内持续释放的新型肿瘤内药物载体，相关成果发表于《Drug Delivery and Translational Research》。

**关键技术方法**

研究人员采用迭代设计策略，首先体外评估157种不同凝胶配方的可注射性和凝胶稳定性，筛选出4种可注射制剂进行进一步评估。利用正电荷季铵微球通过静电作用负载负电荷药物。采用1,4-丁二醇二缩水甘油醚（1,4-butanediol diglycidyl ether, BDDE)交联高分子量透明质酸（hyaluronic acid, HA)，并通过三通旋塞泵入200次使聚合物链沿注射器长轴排列以改善可注射性。以碘海醇（iohexol)和赤藓红（erythrosine)作为放射不透性示踪剂，在约克夏猪肝脏中进行体内生物分布、突释释放和药物释放动力学评估。在Oncopig（携带TP53^R167H突变的基因工程猪）中诱导未分化癌建立肝脏肿瘤模型，进行肿瘤内药物递送和安全性评价。通过非对比CT、荧光测定、酶联免疫吸附测定（ELISA）及分光光度法进行药物定量分析。

**研究结果**

**免疫治疗负载微球**：为负载负电荷药物，研究人员使用正电荷季铵微球（45–165 μm）。研究证实了寡核苷酸（CpG-STAT3^ASO)、干扰素基因刺激因子（stimulator of interferon genes, STING)激动剂（3',3'-cGAMP)、细胞因子（白细胞介素-2即inter我却interleukin-2/interleukin-2, IL-2；干扰素-γ即IFN-γ）和外泌体在微球上的负载能力，负载效率通过上清液中药物浓度变化测定，并经荧光显微镜确认。

**稳定且可注射的放射不透性水凝胶**：初始实验显示羟丙甲纤维素（hydroxypropylmethylcellulose, HPMC)可改善泊洛沙姆407凝胶稳定性；结冷胶可改善明胶凝胶稳定性；BDDE交联可改善HA凝胶稳定性。基于这些发现，选择4种可注射制剂进一步评估：22%泊洛沙姆407+2%HPMC、3.5%明胶+1%结冷胶、4%HA及5%交联HA。仅交联HA能在猪肝脏注射部位保留至少2天，无脱靶递送且突释释放低。

**改善可注射性与流变学特性**：通过三通旋塞泵入200次可改善高分子量交联HA的可注射性，使通过18G针头的注射时间改善10倍以上，同时保留凝胶稳定性。扫描电子显微镜（SEM)证实了聚合物链的排列。载药微球凝胶在注射时呈液体流动，经皮注射入猪肝脏后固化为明确的药物储库。流变学研究显示该微球凝胶为宾汉塑性体（Bingham plastic)，在施加力时油料液化的竇律性流体，低于屈服应力时固化，其屈服应力较单独微球有所改善。

**利用放射不透性示踪剂优化猪肝脏局部药物递送**：鉴于啮齿类动物与人类在药物扩散、血液灌注和药物剂量方面存在显著差异，研究人员选择猪作为大型动物模型。将碘海醇溶于水注射入猪肝脏，结果显示63%突释释放，半衰期仅3.9分钟，且泄漏至门静脉、腹膜和胆管。4种水凝胶中，仅交联HA在注射部位保留至少2天，半衰期延长至5.3小时，突释释放降至9%。然而，单独使用载药微球注射时，93%立即泄漏至门静脉、腹膜和胆管。将赤藓红负载微球嵌入交联HA后，实现低突释释放，半衰期延长至6.3天。

**肿瘤内递送细胞因子、CpG-STAT3^ASO和MMAE**：将IL-2、IFN-γ、CpG-STAT3^ASO和单甲基澳瑞他汀E（monomethyl auristatin E, MMAE)负载于交联HA或微球-交联HA复合物中，注射入Oncopig肝脏肿瘤。这些免疫治疗药物在血管化肝脏中的半衰期为21小时至5.8天，突释释放<1%。安全性评价显示无严重不良事件，无免疫相关不良事件、细胞因子释放综合征或感染，肝功能检测保持正常。单次注射可实现多种药物不同时相释放：含MMAE的交联HA凝胶中嵌入CpG-STAT3^ASO微球，MMAE半衰期约8小时，CpG-STAT3^ASO半衰期140小时。

**体外实验预测体内药物释放和生物分布**：体内药物释放始终快于体外实验，因体内存在血流、酶解和细胞降解等主动释放机制。但体外与体内半衰期存在中度相关性（r2=0.42），体外实验可准确将药物载体分类为快速（<30分钟）、中等（30分钟–10小时）和缓慢（>10小时）释放。体外凝胶稳定性>30天可预测猪肝脏良好的生物分布。

**讨论与结论总结**

研究人员系统评估了多种药物载体用于图像引导经皮免疫治疗药物递送至肝脏肿瘤的性能。水凝胶递送可将突释释放降至<15%，半衰期延长至3–23小时；微球凝胶进一步将半衰期延长至6天。该微球凝胶作为复合材料，整合了载药微球的有利药物结合与释放特性，以及水凝胶的良好局部滞留特性。负电荷药物与正电荷微球间的静电结合实现持续药物释放；交联水凝胶在注射部位形成凝聚性药物储库，防止立即洗脱进入肿瘤内静脉，从而实现低突释释放。通过泵入三通旋塞改善高分子量交联HA的可注射性，使聚合物链排列，注射时间改善10倍以上。

该微球凝胶的模块化设计将局部滞留（凝胶）与药物释放（微球）分离，使每种药物可独立调节释放动力学，实现程序化的时空调控药物递送系统。多种治疗性载荷可安全递送至肿瘤，包括DNA和RNA治疗药物、STING激动剂、细胞因子、免疫原性细胞死亡诱导剂和外泌体。由于低突释释放和长半衰期，毒性药物亦可安全递送至血管化肿瘤。成像引导实现药物靶向，凝胶和药物停留于注射部位，使介入放射科医师能够"描绘"肿瘤。

与现有FDA批准的微球制剂相比，本研究采用的正电荷季铵微球可负载更广泛的负电荷药物，扩展了微球载药范围。体温响应性凝胶、多结构域肽、纳米硅酸盐凝胶、海藻酸盐、壳聚糖和透明质酸等多种可注射水凝胶虽已有研究，但经迭代筛选后仅交联HA满足肝脏注射部位保留、无脱靶递送和低突释释放的标准。

研究局限性包括：IL-2、IFN-γ和CpG-STAT3^ASO的肿瘤内半衰期仅基于注射后1周尸检时的残余药物量单时间点估算；未评估治疗疗效和长期安全性结果；以及 manufacturability、稳定性、储存、GLP毒理学和监管问题尚待解决。

**研究结论**：利用缓释微球凝胶可改善血管化肝脏肿瘤的药物递送。该微球凝胶在注射时呈液体流动，随后固化为肿瘤内药物储库。作为复合材料，其包含负载药物的微球（用于持续、可调节的药物释放），嵌入放射不透性交联水凝胶（用于局部滞留）中。多种治疗性载荷可安全递送至肿瘤，包括寡核苷酸、STING激动剂、细胞因子、免疫原性细胞死亡诱导剂和外泌体。微球凝胶较微球降低突释释放7.8倍，较水凝胶延长半衰期>15倍，从而实现单次注射持续肿瘤内药物释放，且全身毒性低。