《Endocrine Pathology》：Distinct ALK Expression Patterns Are Associated with Canonical and Noncanonical STRN::ALK Transcript Architectures in Oncocytic Thyroid Neoplasms
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嗜酸性粒细胞性甲状腺癌具有独特的染色体图谱特征，且常出现放射性碘治疗抵抗，这突显了改进其分子特征分析的必要性。尽管间变性淋巴瘤激酶（ALK）基因重排，特别是STRN::ALK融合，已在甲状腺癌中被报道，但其在嗜酸性粒细胞性甲状腺肿瘤中的生物学和临床意义尚不明确
嗜酸性粒细胞性甲状腺癌具有独特的染色体图谱特征，且常出现放射性碘治疗抵抗，这突显了改进其分子特征分析的必要性。尽管间变性淋巴瘤激酶（ALK）基因重排，特别是STRN::ALK融合，已在甲状腺癌中被报道，但其在嗜酸性粒细胞性甲状腺肿瘤中的生物学和临床意义尚不明确。该研究采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）对56例嗜酸性粒细胞性甲状腺肿瘤中的STRIATIN（STRN）外显子3-ALK外显子20来源的转录本进行了检测，并对阳性病例进行克隆和Sanger测序。转录本阳性病例进一步通过荧光原位杂交（FISH）、免疫组织化学（IHC）及计算机模拟结构建模进行评估。STRN::ALK来源的转录本在56例肿瘤中的9例中被检出；然而，其检出频率反映了不同转录本结构的合并检测结果。在56例肿瘤中，仅2例（3.6%）携带经典框内STRN::ALK融合，而7例（12.5%）含有非经典框外变异。尽管所有转录本阳性肿瘤无论转录本结构如何均经FISH证实存在ALK重排，但IHC可检测到的ALK蛋白表达仅见于携带经典框内融合的肿瘤，而所有非经典变异均缺乏可检测的ALK蛋白表达。结构建模与这些观察结果一致，提示经典融合保留了激酶结构域特征，而非经典变异则预测存在结构域破坏。总之，嗜酸性粒细胞性甲状腺肿瘤中的STRN::ALK转录本表现出显著的结构异质性，并伴有不同的ALK蛋白表达模式。ALK FISH阳性/IHC阴性的病例应谨慎解读，因其可能并不代表生物学上等同的ALK驱动性肿瘤，治疗相关性尚不确定。综合分子水平和蛋白水平的评估可能有助于嗜酸性粒细胞性甲状腺肿瘤中ALK改变的解读。
甲状腺癌是最常见的内分泌恶性肿瘤，其发病率在全球范围内持续上升。在组织学亚型中，嗜酸性粒细胞性甲状腺癌（oncocytic carcinoma of the thyroid, OCA），旧称Hürthle细胞癌，约占所有甲状腺癌病例的2%至5%。OCA曾被归类为滤泡性甲状腺癌（follicular thyroid carcinoma, FTC）的亚型，但在世界卫生组织（WHO）现行甲状腺肿瘤分类中已被确认为独立的临床病理实体。组织学上，OCA定义为浸润性恶性滤泡细胞肿瘤，由至少75%的嗜酸性粒细胞组成，缺乏甲状腺乳头状癌的核特征及高级别特征。其与良性嗜酸性粒细胞性腺瘤（oncocytic adenoma, OA）的区别在于前者存在包膜和/或血管浸润，而后者有包膜且无侵袭性特征。
超越形态学特征，OCA表现出独特的基因组谱，以广泛的染色体缺失和线粒体功能障碍为特征。同质性线粒体DNA（mtDNA）突变通常影响呼吸链复合体I，常与广泛的杂合性缺失（loss of heterozygosity, LOH）、基因组单倍体化型拷贝数变异、单亲二体及染色体核内复制共存。这种高度不稳定的基因组景观可能促进结构多样的基因组重排产生，包括潜在复发性但生物学异质的融合事件。临床上，部分肿瘤表现出更具侵袭性的行为及较低的碘亲和力，从而限制了放射性碘（RAI）治疗的疗效。这些特征共同突显了进行深入分子特征分析的必要性，其具有潜在的诊断和治疗意义。
在此背景下，涉及受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinases, RTKs）的基因融合已成为甲状腺癌中具有临床意义的致癌驱动因素，对诊断、预后和靶向治疗具有重要价值。其中，涉及间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase, ALK）基因的重排已在多种甲状腺癌亚型中被描述，特别是甲状腺乳头状癌、低分化癌及间变性癌。在甲状腺肿瘤中，STRN（striatin）是最常报道的ALK融合伴侣，最常见的是涉及STRN外显子3和ALK外显子20的经典框内融合。这些STRN::ALK重排通常与可检测的ALK蛋白表达及对ALK靶向治疗的临床反应性相关，突显了其治疗相关性。尽管已有零星ALK重排的嗜酸性粒细胞性甲状腺肿瘤病例报道，但STRN::ALK改变在专门的嗜酸性粒细胞队列中尚未被系统研究。
研究人员在本研究中采用整合方法，结合基于转录本的检测、Sanger测序、荧光原位杂交（FISH）、免疫组织化学（IHC）及计算机模拟结构建模，对专门队列中的嗜酸性粒细胞性甲状腺肿瘤进行了STRN外显子3-ALK外显子20来源转录本的评估。研究发现揭示了嗜酸性粒细胞性甲状腺肿瘤中STRN::ALK转录本结构的异质性，并提示尽管基因组ALK重排可通过FISH在不同转录本变异中得以确认，仅经典框内融合与可检测的ALK蛋白表达及预测的激酶结构域特征保留相关。
该研究为单中心回顾性研究，纳入了1995年至2015年间在巴西圣保罗联邦大学附属医院（Hospital S?o Paulo, Universidade Federal de S?o Paulo, UNIFESP）接受甲状腺切除术患者的连续福尔马林固定石蜡包埋（formalin-fixed, paraffin-embedded, FFPE）甲状腺标本，诊断为嗜酸性粒细胞性甲状腺癌或腺瘤。所有病例由专家甲状腺病理学家根据2022年WHO甲状腺肿瘤诊断标准进行复核和重新分类。研究队列最终包括27例OCA和29例OA病例（样本队列来源：巴西圣保罗联邦大学附属医院，1995-2015年）。
研究人员采用的主要关键技术方法包括：针对STRN外显子3-ALK外显子20连接位点的靶标RT-PCR筛查；阳性病例的TOPO TA克隆和Sanger测序以验证融合转录本并定位断裂点序列；对所有9例RT-PCR阳性病例进行ALK双色分离式FISH分析以确认基因组重排；使用D5F3抗体进行ALK免疫组织化学检测以评估蛋白表达；以及利用ExPASy Translate Tool和Phyre2平台进行计算机模拟结构建模与预测功能评估。
**经典和非经典STRN::ALK来源转录本在嗜酸性粒细胞性甲状腺肿瘤中的检测**
通过靶标RT-PCR筛查，56例嗜酸性粒细胞性甲状腺肿瘤中有9例（16%）检出STRN::ALK来源的转录本。其中，2例OCA产生约94 bp的扩增子，与预期经典框内STRN::ALK融合大小一致；其余7例阳性肿瘤（5例OCA和2例OA）显示较短的约50 bp非典型扩增子，提示存在非经典STRN::ALK来源的转录本。Sanger测序证实，2/56例肿瘤（3.6%）的94 bp扩增子对应于经典框内融合转录本序列。在其余7/56例肿瘤（12.5%）中，克隆RT-PCR产物的Sanger测序确认了保留外显子3-外显子20连接背景但序列构型不同于经典框内融合的STRN::ALK来源序列，该发现经独立PCR反应和重复克隆验证一致。非经典STRN::ALK来源转录本被描述性分类为两种复发模式：I型变异（病例4、9、11、12），以影响预期编码框连续性的序列改变为特征；II型变异（病例7、28、40），其序列构型预测在假定的融合转录本中引入提前终止密码子。对复发性非经典连接位点的序列分析未识别出一致的微同源性、直接重复基序或其他明显支持系统性聚合酶滑移或复发性RT-PCR假象生成的序列特征。
**基因组验证确认经典和非经典变异中均存在ALK重排**
分离式FISH在全部9例RT-PCR阳性肿瘤中确认了ALK重排，分裂信号检出比例为12%至58%。ALK重排信号既见于经典框内融合病例，也见于框外变异病例。该结果证实，无论转录本结构如何，基因组水平的ALK重排均可被FISH检测确认。
**ALK蛋白表达仅局限于经典STRN::ALK嗜酸性粒细胞性甲状腺癌**
ALK蛋白表达仅在携带经典框内融合的肿瘤中被观察到。具体而言，弥漫性胞质ALK免疫反应性仅见于具有经典STRN::ALK融合的嗜酸性粒细胞性甲状腺癌。相反，所有携带非经典框外变异的肿瘤均缺乏可检测的ALK表达，任何病例中均未观察到局灶性、微弱或不确定的肿瘤染色。匹配的相邻正常甲状腺组织ALK表达始终阴性。
**结构建模提示框外变异中激酶结构域特征的破坏**
基于同源建模的结构建模提示，经典STRN::ALK融合保留了完整的ALK激酶结构域结构，与激酶核心关键结构元素的保留一致。相反，所有框外变异均表现出结构破坏，并分为两种复发性结构：I型变异预测编码约685个氨基酸的蛋白，存在内部缺失影响ALK来源区域的连续性，导致激酶相关序列的部分保留及预测结构无序性增加；II型变异预测由于提前终止而产生约145个氨基酸的严重截短蛋白，主要由STRN来源序列组成，缺乏ALK编码区域。结构相似性分析与此观察一致：经典融合与整体激酶结构域组织的保留相容，而非经典变异在I型变异中表现出预测的结构破坏，在II型变异中则缺乏激酶结构域特征。这些发现共同提示不同融合结构间激酶结构域组织保留的差异；然而，这些结论基于计算机模拟建模，代表结构推断而非激酶活性的直接实验证据。
**经典STRN::ALK融合仅见于恶性嗜酸性粒细胞性肿瘤**
经典STRN::ALK融合仅在嗜酸性粒细胞性甲状腺癌中观察到，占56例肿瘤总数的3.6%，占27例OCA中的7.4%。在基线临床病理特征方面，包括患者性别、年龄、肿瘤大小或其他可用的肿瘤侵袭性指标，携带经典框内融合的肿瘤与分类为非经典STRN::ALK来源变异的肿瘤之间未观察到显著差异。
在讨论部分，研究人员指出这是首个采用整合RNA、基因组和蛋白水平方法，在专门的嗜酸性粒细胞性甲状腺肿瘤队列中对STRN外显子3-ALK外显子20来源转录本进行特征分析的研究。研究发现表明，STRN::ALK阳性嗜酸性粒细胞性甲状腺肿瘤包含不同的转录本结构，这些结构与不同的ALK蛋白表达模式相关联。尽管所有转录本阳性肿瘤均经FISH确认了基因组ALK重排，但可检测的ALK蛋白表达仅局限于经典框内融合，而非经典变异则始终保持免疫阴性。这些发现提示融合结构可能影响激酶结构域组织的保留和ALK蛋白表达，支持对嗜酸性粒细胞性甲状腺肿瘤中ALK重排的谨慎解读。
经典和非经典STRN::ALK来源转录本均在FISH证实存在基因组ALK重排的肿瘤中被识别，这表明基因组水平的ALK破坏本身可能无法预测下游蛋白表达。ALK免疫反应性仅局限于携带经典框内融合的肿瘤，加上这些病例中预测的激酶结构域组织保留，提示仅部分ALK重排的嗜酸性粒细胞性甲状腺肿瘤产生与稳定ALK蛋白表达相容的融合转录本。这些观察结果支持基因组、转录本和蛋白水平之间存在层级关系，其中ALK重排的生物学后果可能取决于融合结构而非单独的重排状态。
非经典变异在独立PCR扩增、克隆和测序实验中的复发性检测支持了本研究实验条件下这些发现的可重复性。此外，所有非经典转录本均与FISH确认的ALK重排相关联。这些观察结果共同提示，识别的变异不太可能代表纯粹随机的技术假象。然而，鉴于使用了存档FFPE材料、短扩增子RT-PCR和克隆-based Sanger测序，无法完全排除其他解释，包括RNA片段化、模板转换、较短产еш的优先扩增及序列依赖性PCR假象，这些因素可能共同促成所观察到的连接结构多样性。
结构建模表明经典融合保留了ALK激酶结构域结构，而非经典变异则与预测的结构破坏相关。然而，这些计算机模拟预测应被解读为支持性而非确定性的功能完整性证据。额外的生物学考虑进一步复杂化了这些变异的解读。含有提前终止密码子的框外转录本，特别是归类为II型的变异，可能受到无义介导的mRNA降解（nonsense-mediated mRNA decay, NMD）的影响，潜在限制了稳定蛋白产物的产生，并提示某些预测截短蛋白可能并非体内表达。即使缺乏保留的激酶结构域特征，保留STRN来源区域的STRN::ALK融合产物理论上也可能独立于ALK信号发挥生物学效应。特别是，潜在的ALK非依赖性机制，包括STRIPAK复合体组装和PP2A相关信号通路的破坏，可能值得考虑，鉴于STRN（striatin）在该网络中的支架作用。尽管这些考虑具有推测性，但它们进一步支持将非经典变异解读为生物学意义不确定的重排。
与之一致，FISH与IHC之间的不一致可能反映了融合结构的差异而非单一统一的ALK改变，这一现象在其他肿瘤类型包括甲状腺肿瘤中也有报道。在嗜酸性粒细胞性甲状腺肿瘤中，这在显著的线粒体积累和基因组不稳定性背景下尤为相关，这些因素可能促进具有可变生物学后果的结构多样重排。
canonical STRN::ALK融合在该队列中仅见于嗜酸性粒细胞性甲状腺癌，而非经典变异则见于癌和腺瘤中。鉴于经典病例数量有限，这一观察应谨慎解读，视为对现队列的描述性发现而非肿瘤类型特异性生物学分布的证据。尽管经典组与非经典组之间未识别出显著的临床病理差异，但这些比较显著不足，不应被解读为生物学等效的证据。然而，经典框内融合局限于恶性肿瘤的可能性提示，结构完整的重排可能更可能产生具有生物学意义的ALK蛋白产物。
这些改变的明显罕见性和异质性，以及队列组成的差异，也可能解释Gopal等和Ganly等两项大型嗜酸性粒细胞性甲状腺癌基因组分析研究中未检出ALK重排的原因，尽管有孤立报道经FISH和免疫组化证实的ALK重排嗜酸性粒细胞性甲状腺肿瘤。在本队列中，尽管使用靶标检测在56例肿瘤中有9例（16%）检出STRN::ALK来源转录本，仅2/56例（3.6%）携带与可检测ALK蛋白表达相关的经典框内融合。这些观察提示，生物学相关的经典STRN::ALK改变可能代表比单独转录本检测率所暗示的更小比例的嗜酸性粒细胞性甲状腺肿瘤亚群，而结构非典型转录本可能促成研究间的表观差异性。队列组成、检测设计和结构改变转录本检测敏感性的差异也可能促成这些差异。这些观察共同提示，整合分子和蛋白水平的评估可能在ALK状态解读和ALK靶向治疗未来研究的分层中发挥潜在作用。
该研究存在固有设计局限性。靶标RT-PCR方法仅限于单一STRN外显子3-ALK外显子20连接构型，因此未能捕获ALK融合多样性的完整谱。相应，涉及STRN或ALK内替代断裂点及非STRN融合伴侣的ALK融合可能被遗漏。此外，存档FFPE材料中的RNA降解可能导致假阴性RT-PCR结果，尽管存在潜在的底层基因组ALK重排。RT-PCR阴性/FISH阳性不一致病例的可能性无法排除，因为FISH分析仅限于RT-PCR阳性肿瘤，引入了一定程度的确定偏倚。因此，报告的检出率反映检测性能而非嗜酸性粒细胞性甲状腺肿瘤中ALK重排的真实流行率。FFPE来源RNA本质片段化，增加了短扩增子检测中假象的易感性。尽管序列检查未识别出提示聚合酶滑移的微同源性、直接重复或其他特征，序列依赖性假象无法排除。而且，分析产物来源于RT-PCR扩增、克隆和测序的片段，因此代表检测来源的转录片段而非全长融合转录本。克隆-based Sanger测序对转录本复杂性的分辨率有限，且受扩增偏倚影响，可能优先富集特定扩增子而低丰度变异代表性不足。因此，基于免疫组化和计算机模拟结构建模的功能解读应被视为初步的，因这些方法未提供生物学活性的直接实验验证。需要正交方法，包括长读长RNA测序、全面基因组分析和功能实验，以确定转录本结构和生物学相关性。值得注意的是，结构不同的STRN::ALK来源转录本在独立病例中的复发性检测支持了研究发现的稳健性，并反对孤立的技术假象。
研究结论指出：嗜酸性粒细胞性甲状腺肿瘤中的STRN::ALK重排似乎包含两类具有不同结构和预测功能特征的类型：罕见的经典框内融合，与可检测的ALK蛋白表达及预测的激酶结构域特征保留相关；以及更常见的非经典变异，结构改变且生物学意义不确定。总之，这些发现提示STRN::ALK来源转录本的单独检测可能无法统一反映生物学相关的融合蛋白表达，支持在解读STRN::ALK阳性嗜酸性粒细胞性甲状腺肿瘤时进行整合分子解释的重要性。
