西班牙COVID-19大流行期间腹泻儿科患者胃肠道病原体感染状况：一项基于分子检测的多中心前瞻性研究

《European Journal of Pediatrics》：Gastrointestinal pathogens in paediatric patients with diarrhoea during the COVID-19 pandemic in Spain: a multicentre molecular-based prospective study

　　

摘要：胃肠炎是全球幼儿发病的主要原因之一。研究人员于2020年9月至2021年9月在西班牙三家三级医院开展了一项前瞻性多中心研究，旨在评估不同西班牙地区引起小儿胃肠炎的胃肠道病原体负担、了解COVID-19大流行对其发病率的影响，并评估感染的潜在危险因素。研究人员采用聚合酶链反应(PCR)分析0–59月龄急性或慢性腹泻患儿的粪便样本，以检测和鉴定胃肠道细菌、寄生虫及病毒，并对聚集性Escherichia coli（大肠杆菌，E. coli）分离株进行全基因组测序(Whole Genome Sequencing, WGS)。流行病学与临床数据采用单变量及多变量logistic回归模型分析。共纳入1114名儿童（中位年龄16个月；男性57.3%）。最常见细菌为肠致病性E. coli(Enteropathogenic E. coli, EPEC)（16.0%）和Campylobacterspp.（弯曲菌属）（15.0%）；蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia duodenalis)（9.8%）与微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)（1.8%）为最常见寄生虫，诺如病毒(Norovirus)（5.5%）为最常见病毒。分子分析显示所有病原体均具显著遗传多样性。Campylobacter感染随年龄增长而增加，与发热及血便相关；诺如病毒感染随年龄增长而减少，与呕吐相关。结论：COVID-19防控措施显著改变了儿童粪口传播胃肠道病原体的传播模式，尤其降低了人适应型（人传人型/anthroponotic）病原体如人隐孢子虫(Cryptosporidium hominis，C. hominis)及地方性聚集性E. coli(Enteroaggregative E. coli, EAEC)特定亚型的人际传播，人畜共患（zoonotic）病原体则基本未受影响，凸显非药物干预措施(Non-pharmaceutical Interventions, NPIs)对人传人传播的选择性影响。

论文解读：西班牙COVID-19大流行期间儿童腹泻患者胃肠道病原体分子流行病学多中心前瞻性研究

该研究发表于《European Journal of Pediatrics》。目前西班牙对引起小儿胃肠炎的常见胃肠道(Gastrointestinal, GI)病原体（如Campylobacter jejuni/coli、Salmonella spp.、Shigella spp.、Yersinia enterocolitica、致病性大肠杆菌(Diarrheagenic Escherichia coli, DEC)、蓝氏贾第鞭毛虫Giardia duodenalis、Cryptosporidium spp.等）虽列为法定报告传染病，但缺乏全国性监测数据，真实疾病负担不明。既往西班牙仅有一项单中心马德里研究报道大流行期间部分病毒、细菌及寄生虫检出率下降，尚无从多地区、多病原体分子水平全面评估COVID-19非药物干预措施(Non-pharmaceutical Interventions, NPIs)（封城、社交距离、停课、手卫生等）对西班牙儿童粪口传播病原体——特别是区分人适应型(anthroponotic)与人畜共患(zoonotic)病原体——影响的证据。为此，研究人员开展此项前瞻性多中心分子流行病学研究，以明确疫情期间西班牙不同地区致小儿腹泻GI病原体谱、NPIs对其流行的选择性影响及感染危险因素，最终发现NPIs显著阻断了人适应型病原体（C. hominis及地方性EAEC亚型）的人传人传播，而对人畜共患GI病原体无明显影响，为理解公共卫生干预措施对肠道传染病传播的差异化作用提供了分子流行病学证据。

主要关键技术方法：

研究人员于2020年9月至2021年9月从西班牙马德里、巴利亚多利德、莱昂三家三级医院急诊科及住院/门诊连续收集0–59月龄急性（≤2周）或慢性（＞4周）腹泻患儿未重复新鲜粪便标本1114份。提取总DNA及病毒RNA后，分别采用常规PCR检测DEC五大经典毒力基因（stx1/stx2/stx2f、eae、aatA、bfpA、eltA/estA、ipaH）并分离EAEC做全基因组测序(Whole Genome Sequencing, WGS)；采用实时荧光PCR(Real-Time PCR, RT-PCR)检测Salmonella spp.、Campylobacter jejuni/coli、Vibrio spp.、Yersinia spp.、Aeromonas spp.；采用PCR及Sanger测序对Giardia duodenalis（ssu rRNA、gdh/bg/tpi基因分 assemblage）、Cryptosporidium spp.（ssu rRNA检测、gp60基因分型）、Blastocystis（ssu rRNA及亚型Subtype, ST鉴定）、Enterocytozoon bieneusi（ITS区）进行寄生虫检测与基因分型；采用多重逆转录PCR(Reverse Transcription PCR, RT-PCR)检测并分型轮状病毒、诺如病毒(GI/GII genogroup)、腺病毒40/41型、星状病毒。流行病学与临床症状数据采用单变量χ2检验及多变量logistic回归（后退法筛选，P＜0.2入组，似然比检验）分析。

研究结果

Occurrence of gastrointestinal pathogens（胃肠道病原体检出情况）：

1114名儿童中530例(47.6%)所有GI病原体均为阴性，427例(38.3%)为单一感染，157例(14.1%)为混合感染（两重139例、三重17例、四重1例）。细菌中以EPEC(16.0%, 178/1114)和Campylobacter spp.(15.0%, 167/1114)最高，其他细菌＜3%，未检出Vibrio；寄生虫以G. duodenalis(9.8%, 109/1114)和Cryptosporidium spp.(1.8%, 20/1114)为主，Blastocystis(＜1%)、E. bieneusi(＜1%)，未检出Entamoeba histolytica/dispar；病毒以Norovirus GII(5.5%, 61/1114)和Astrovirus(1.3%, 14/1114)为主，腺病毒及轮状病毒＜1%。EPEC感染多仅表现为腹泻(87.6%)，Campylobacter感染12.6%伴血便，Salmonella 8.0%伴血便，G. duodenalis可伴发热/腹痛/呕吐，Norovirus感染6.6%伴呕吐。

Molecular characterisation of EAEC（聚集性大肠杆菌EAEC分子特征）：

17份EAEC阳性样本均获分离株，全基因组测序鉴定出9种序列型(Sequence Type, ST)，最常见为ST10(47.1%)和血清基因型O153:H2(23.5%)；与大流行前西班牙数据相比，疫情前占比较高的流行亚型O126:H27-ST200、O111:H21-ST40及O92:H33-ST34在本研究中完全缺失或极罕见(仅1株O92:H33-ST34)，提示NPIs打断了这些人传人EAEC亚型的社区传播。

Molecular characterisation of gastrointestinal parasites（胃肠道寄生虫分子特征）：

G. duodenalis成功分型的11例中， assemblage B(亚型BIII、BIV)占82%(9/11)，assemblage A(亚型AII)占18%(2/11)。全部20例Cryptosporidium阳性经gp60分型均为人畜共患C. parvum（家族IIa为主，少量IId），未检出本应在西班牙占主导的人适应型C. hominis，提示人传人C. hominis传播被NPIs抑制。Blastocystis 19例阳性中ST1、ST2、ST4均有检出，未检出常见人传人亚型ST3。E. bieneusi检出2例，分别为已知基因型D和新基因型HhSpEb1——系西班牙首次在免疫功能正常儿童中报道。

Molecular characterisation of gastrointestinal viruses（胃肠道病毒分子特征）：

Astrovirus以经典基因型1(92.9%)为主；人腺病毒均为肠道腺病毒F组基因型41(Adenovirus 41, HAdV-F41)；Norovirus以GII.3P12最常见，次为GII.4P16；Rotavirus以G2P4和G4P8为主，含1例疫苗衍生G1P[8]。

Risk factor analysis: univariable analysis（危险因素分析：单变量分析）：

Campylobacter多见于25–59月龄(P＜0.001)，与发热、血便、慢性腹泻显著关联；EPEC主要仅表现为腹泻(P＝0.03)，与诺如病毒及轮状病毒共感染有关；Norovirus多见于＜25月龄(P＝0.01)且与呕吐相关(P＝0.001)；Salmonella与Cryptosporidium感染也多见于较大龄儿童(25–59月龄)；G. duodenalis与产Stx大肠杆菌(Shiga toxin-producing E. coli, STEC)共感染有相关性。

Risk factor analysis: multivariable analysis（危险因素分析：多变量分析）：

Campylobacter感染独立危险因素为25–59月龄(aOR＝2.63)、发热及血便；Norovirus感染25–59月龄显著降低(aOR＝0.34)，呕吐为其独立预测因子(aOR＝6.47)；EPEC与"任意GI病毒"共感染相关(aOR＝2.11)，且多仅表现为腹泻；Salmonella感染男性低于女性(aOR＝0.40)，同样多见于25–59月龄(aOR＝4.06)；Cryptosporidium感染随年龄显著增加(P＝0.0001)；G. duodenalis和Blastocystis无显著临床/人口学关联因子。

讨论与结论总结：

研究人员指出本研究优势在于西班牙三地区大样本、覆盖20种GI病原体的分子检测、阳性样本基因分型及全面危险因素分析。与大流行前数据比对发现EAEC（尤其O126:H27-ST200、O111:H21-ST40、O92:H33-ST34等典型人传人亚型）及STEC检出率显著降低，而Campylobacter、Salmonella等人畜共患细菌及C. parvum未受明显影响。所有隐孢子虫阳性均为人畜共患C. parvum，未见本应占多数的西班牙本土人适应型C. hominis，与人适应型隐孢子虫靠密切接触人传人、易受社交隔离影响的传播特性相符，与英格兰、威尔士、苏格兰、新西兰及瑞典报道趋势一致，系西班牙首例分子层面证据。Blastocystis人传人亚型ST3缺失亦支持NPIs抑制人传人肠道原虫。寄生虫Giardia duodenalis仍以assemblage B为主，符合西班牙既往调查。病毒基因型分布与西班牙既往流行株一致，轮状病毒少见基因型可能反映疫情期间监测变动。危险因素分析与大型多中心MAL-ED研究结论吻合——Campylobacter与发热血便、Norovirus与呕吐及低龄的相关性具鉴别价值，EPEC常仅表现为腹泻且与病毒共检出现。局限性包括单时段（无同期全国对照及本地大流行前平行队列）、PCR可能检出无症状携带、多方法组合潜在敏感性差异、地域代表性局限。

结论（翻译）：

COVID-19防控措施显著改变了儿童粪口传播胃肠道病原体的传播动态。严格封控、出行限制及社交距离选择性地打断了人适应型病原体（如C. hominis及地方性EAEC特定亚型）的人际传播，而人畜共患病原体基本不受影响，凸显非药物干预措施对人传人传播途径的选择性阻断效应，证明此类公共卫生措施能够重塑常见胃肠道病原体的流行病学格局。