定量极紫外叠层衍射成像揭示生理与抗生素胁迫下细菌的纳米级形态响应

《PhotoniX》：Quantitative EUV ptychography reveals nanoscale morphological responses of bacteria under physiological and antibiotic stress

　　

桌面式极紫外（EUV）叠层衍射成像（ptychography）可实现纳米级、无标记且定量的成像，并具有本征的元素敏感性，为细菌形态与成分的亚细胞分析提供了一种独特的模态。在本研究中，研究人员将最先进的EUV叠层衍射显微镜系统性地应用于两种模式原核生物——大肠杆菌（Escherichia coli）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的结构与成分特征研究。凭借桌面式平台上44 nm分辨率的定量振幅与相位重建，研究人员基于独特的形态学特征可视化了细菌芽孢形成过程中的细微现象。值得注意的是，研究人员研究了枯草芽孢杆菌对抗生素莫那霉素（monazomycin）的单细胞响应，揭示了超结构破坏与成分改变。为进一步表征表型变异，研究人员对提取的形态学特征进行了多元统计分析，揭示了与确定生物学状态相关的多样性及聚类模式。该研究确立了EUV叠层衍射成像作为一种强大的、具有元素敏感性的无标记细菌成像平台，展示了其在生物医学与抗菌研究中的应用前景。

细菌 infections 对人类健康构成重大威胁，这推动了对精密诊断工具以及细菌结构、生理状态和对抗菌剂响应深入表征的需求。尽管聚合酶链式反应（PCR）、质谱（mass spectroscopy）和拉曼光谱（Raman-based spectroscopy）等成熟的分子技术能够提供有关细菌 identity 的有价值信息，但这些方法缺乏空间分辨率，且通常需要扩增或标记。包括超分辨荧光显微镜、原子力显微镜（AFM）、磁共振成像（MRI）、软X射线显微镜和冷冻电子显微镜在内的高级显微方法虽然为细菌超结构提供了宝贵见解，但各有权衡：荧光显微镜的标记程序通常复杂耗时，可能引入形态学伪影或改变生理状态；AFM和电子显微镜（EM）虽能提供高分辨率成像，但深度信息有限；而X射线方法则特别容易发生辐射诱导损伤、样本制备复杂或缺乏成分敏感性。这些权衡凸显了对紧凑、无标记、非破坏性且具有优异材料对比度成像技术的迫切需求，该技术能够解析细菌亚细胞形态特征。

相干衍射成像（CDI）及其扫描变体叠层衍射成像（ptychography）通过计算从一系列衍射图案中重建透射或反射波场的振幅和相位，已在生物研究中 attracted considerable attention。在极紫外（EUV, 10—100 eV）光子能量范围内，叠层衍射成像虽已在纳米技术、波前传感和反射测量中得到广泛应用，但其生物应用因 hydrated 样品对EUV的强烈吸收而受限。尽管如此，EUV叠层衍射成像对干燥生物样品具有独特优势：短波长可实现纳米级空间分辨率，而众多原子共振（尤其是生物相关元素碳、氮、氧和磷）可在无需标记或染色的情况下为脱水细胞提供强本征元素对比。

基于高次谐波产生（HHG）的高通量实验室EUV光源的最新进展促进了紧凑EUV叠层衍射显微镜的发展。本研究中，研究人员采用了一台升级后的EUV叠层衍射显微镜，工作于92 eV，具有优化的照明光学、低噪声sCMOS探测器和新开发的基于纯度的自动聚焦算法，实现了44 nm分辨率，成像速度较先前生物样本EUV成像研究提高了四倍。

研究人员对两种模式细菌——革兰氏阴性菌大肠杆菌和革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌——进行了系统的EUV叠层衍射研究，样本为未经染色的风干样品，未经化学固定。在亚50 nm半间距分辨率下，EUV叠层衍射测量揭示了两种细菌在形态和成分上的差异。振幅（A）和展开相位（φ）图像反映了细胞的吸收和折射特性。由此提取的散射对比度（f_c = √[ln²|A| + φ²]）和散射商（f_q = φ/lnA）图谱分别强调了散射强度和材料对比。E. coli细胞呈现出更清晰分层的外包膜，而B. subtilis则显示更弥散的内部轮廓。E. coli在高对比度的外边界（f_q > 5）表现出与脂类和脂多糖（LPS）富集的外膜一致的特征，而B. subtilis则呈现局部化的f_c热点和较低的f_q值，可归因于革兰氏阳性菌中厚的肽聚糖层中的碳水化合物丰富结构。人口水平比较显示，通过Mann-Whitney U检验确认两种细菌类群间存在统计学显著差异（p ? 0.001），效应量大（Cliff's δ = 0.87）。

在枯草芽孢杆菌芽孢形成研究中，研究人员使用MnSO₄处理创造有利于芽孢形成的条件。长期培养导致营养耗竭，产生细菌和芽孢的异质混合物。复值重建图像揭示了棒状细胞和椭球形芽孢结构。分辨率分析通过傅里叶环相关（FRC）表明衍射受限半间距分辨率为44 nm。选定区域详细分析显示，尽管振幅和相位表明芽孢比细胞更致密，散射商仍相对均匀，表明平均成分相似。连接多个芽孢的丝状结构在相位和散射商中显示尖锐峰值，提示不同的局部成分。三个单独芽孢的 coat 分析显示对数振幅图中的同心层状结构，与已建立的B. subtilis芽孢 coat 组装一致：外部高吸收脊对应蛋白质丰富的 coat（约80 nm），其下为皮层（cortex，约100 nm宽的保护性肽聚糖富集区）。最外层多糖 crust 层厚度低于分辨能力。

在莫csi霉素对枯草芽孢杆菌的作用研究中，研究人员将相同培养条件下的B. subtilis分为10 μg/mL莫那霉素处理组和未处理对照组。与对照组相比，处理细胞显示显著形态改变，包括散射密度增加、不规则形状变形和内部均匀性降低。散射商图谱揭示了处理细胞外周附近频繁出现的壳状层（f_q > 5），提示莫那霉素诱导的膜双层紊乱或脱离。

为进行大规模定量分析，研究人员实施了基于单细胞特征的多元分析流程。使用深度学习分割算法Cellpose-SAM从14幅代表性重建图像中分割了474个细胞（对照组4幅，处理组10幅），提取了九项特征：振幅和相位通道的均值、标准差（std）和相对标准差（RSD）、基于振幅和相位的边缘粗糙度、散射度量（f_c和f_q）、投影细胞面积和估计密度。三维主成分分析（PCA）显示，前两个主成分分别占总方差的52.77%（PC1）和20.25%（PC2），在处理组与对照组之间揭示了沿这些轴的明显分布分离。f_c密度和粗糙度相关特征对PC1贡献最强，而PC2主要由投影面积和f_c的RSD主导。

通过K-means算法进行的基于相似性的无监督聚类（K=4，由轮廓分析确定）识别了四个主要聚类。聚类0主要由未处理对照细胞（n=99）和少量受影响轻微的处理细胞（n=32）组成，表现为低表型变异。聚类1（n=147）以振幅粗糙度和相位异质性增加为特征，代表肽聚糖增厚和细胞包膜层分离的表型。聚类2（n=101）包含投影面积增大、相位对比度降低的表型，提示肿胀、膜膨出和出芽。聚类3（n=56）占据PC1极端正端，代表振幅粗糙度显著增加和相位完整性完全丧失的表型，与严重的包膜破裂和胞质泄漏一致，代表终端裂解状态。聚类1—3完全由莫那霉素处理细胞组成，揭示了从完整到高度破坏状态的连续表型进展。

在讨论与展望部分，研究人员指出EUV叠层衍射成像能够在多种生物学背景下对细菌细胞进行定量、无标记成像，包括不同细菌物种、发育状态和抗生素诱导的破坏。与革兰氏阳性和革兰氏阴性菌的比较成像揭示了散射商图谱中的显著差异，归因于其不同的细胞壁组成。B. subtilis芽孢形成的可视化揭示了44 nm分辨率下的亚细胞形态特征。对莫那霉素响应的研究揭示了表型状态的连续性，这一梯度得到了基于特征的聚类和视觉表型分析的支持。

研究结论部分指出，该研究展示了EUV叠层衍射成像为细菌系统提供结构和生物物理见解的独特潜力，提供了对生理和病理转变的定量视角，并通过其纳米分辨率下的本征元素特异性补充了传统成像技术。随着紧凑EUV和软X射线叠层衍射显微镜的持续演进，研究人员预期这些技术在微生物学和医学诊断中将发挥日益重要的作用，特别是在纳米级结构与功能交汇的领域。