STK38依赖的RIPK1丝氨酸309磷酸化对坏死性凋亡的物种特异性调控

《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》：Species-specific regulation of necroptosis by STK38-dependent RIPK1 phosphorylation

　　

受体相互作用蛋白激酶1（Receptor-interacting protein kinase 1，RIPK1）是调控细胞死亡、炎症及肿瘤发生的关键应激感受器，但RIPK1如何被激活尚不清楚。本研究鉴定丝氨酸/苏氨酸激酶38（serine/threonine kinase 38，STK38）为新型RIPK1直接激活因子。STK38结合RIPK1并整合入含RIPK1的死亡复合物，加速RIPK1依赖的细胞死亡；STK38缺失抑制RIPK1介导的坏死性凋亡与凋亡。TNF-α刺激触发MEKK2依赖的STK38活化，后者磷酸化RIPK1丝氨酸309（Ser309），该位点仅于高等灵长类保守。S309磷酸化破坏RIPK1与其抑制性激酶MK2的相互作用，从而抑制S320磷酸化并促进RIPK1活化。结直肠癌样本分析显示STK38表达、RIPK1活化状态与患者良好预后呈正相关；STK38缺陷使细胞抵抗RIPK1依赖细胞死亡并促进异种移植模型中肿瘤进展。研究人员发现STK38是RIPK1激活因子，揭示了一条人类特有的RIPK1介导细胞死亡新调控机制。

本文于2026年发表于《Cell Death and Differentiation》，报道了丝氨酸/苏氨酸激酶38（STK38/NDR1）作为受体相互作用蛋白激酶1（RIPK1）上游激活激酶，通过磷酸化RIPK1中间结构域保守Ser³⁰⁹（仅高等灵长类存在），解除MK2介导的Ser³²⁰抑制性磷酸化，从而促进RIPK1激酶自磷酸化（Ser¹⁶⁶）及坏死性凋亡（necroptosis）/凋亡复合体组装的新机制，并证实该STK38–RIPK1(S309)轴在结直肠癌中具有抑癌及预后指示价值。

主要关键技术方法：

研究人员采用RIPK3免疫沉淀偶联质谱（MS）筛选坏死体互作蛋白；利用CRISPR–Cas9构建STK38、RIPK1、MEKK2基因敲除（KO）及定点突变回补细胞系（HT-29、HeLa、HEK293T）；通过免疫共沉淀（Co-IP）、GST pull-down及体外激酶实验验证蛋白互作与磷酸化位点；制备磷酸化RIPK1 Ser³⁰⁹位点特异性抗体并进行λ-磷酸酶验证；借助TCGA数据库分析及268例结直肠癌（CRC）患者组织芯片免疫组化（IHC）评估临床相关性；建立HT-29皮下异种移植裸鼠模型联合TRAIL/Birinapant/Emricasan处理评估体内肿瘤抑制作用。

研究结果：

STK38 enhances TNF-α-induced cell death in a kinase activity-dependent manner（STK38以激酶活性依赖方式增强TNF-α诱导的细胞死亡）

通过RIPK3复合物质谱筛选获得STK38及其旁系同源物STK38L为候选调节因子。CRISPR–Cas9敲除STK38显著抑制TNF-α+Smac模拟物Birinapant+泛caspase抑制剂zVAD-fmk（TBZ）诱导的HT-29细胞坏死性凋亡及RIPK1/RIPK3/MLKL磷酸化；回补野生型（WT）STK38而非激酶死突变体（K118R）可恢复坏死性凋亡敏感性。STK38缺失亦减弱TNF-α+Birinapant诱导的凋亡。表明STK38是RIPK1依赖细胞死亡的正向调节因子且依赖其激酶活性。

STK38 associates with the cell death complex in a RIPK1-dependent manner（STK38以RIPK1依赖方式募集至细胞死亡复合物）

STK38缺失不影响NF-κB活化及复合物I形成。Co-IP显示TBZ处理后STK38与RIPK1、RIPK3、MLKL及caspase-8共沉淀；RIPK1激酶抑制剂GSK'963削弱STK38与RIPK3/MLKL结合但不影响与RIPK1结合，而RIPK3或MLKL抑制剂无影响。RIPK3敲低不影响STK38–RIPK1结合，但RIPK1 KO后STK38不与RIPK3/MLKL结合。免疫荧光证实TBZ刺激后STK38与RIPK1共定位胞质灶点。表明STK38经RIPK1招募入坏死体/凋亡复合物II。

STK38-RIPK1 interaction depends on the kinase and RHIM domains（STK38与RIPK1相互作用分别依赖STK38激酶结构域与RIPK1中间结构域RHIM基序）

Domain mapping显示RIPK1中间结构域（ID，aa304–558）最强结合STK38，删除RHIM基序（ΔRHIM）明显减弱结合，但RHIM核心四联体（IQIG→AAAA）突变不影响结合，提示STK38识别RHIM非经典界面；STK38仅结合RIPK1与RIPK3的RHIM，不结合ZBP1或TRIF。STK38激酶结构域（KD，aa83–380）足以结合RIPK1，激酶死突变（K118R）结合减弱。表明STK38通过激酶结构域结合RIPK1中间结构域RHIM，且需激酶活性构象。

MEKK2-mediated activation of STK38 promotes interaction with RIPK1 during TNF-α-induced cell death（MEKK2介导的STK38活化促进TNF-α诱导细胞死亡中STK38与RIPK1相互作用）

TBZ处理诱导STK38 Thr⁴⁴⁴磷酸化（活化标志）。Co-IP确认STK38与MEKK2相互作用，MEKK2 KO降低STK38 pT444及TBZ诱导坏死性凋亡/坏死体组装，表型类似STK38 KO；MEKK2不进入坏死体且不结合RIPK1。MEKK2 KO削弱STK38–RIPK1结合。HEK293T中MEKK2过表达增强STK38–RIPK1结合，该增强依赖STK38 T444（转磷酸化位点）及S281（自磷酸化位点），K118R及S281A突变消除此增强作用。表明MEKK2上游激活STK38使其处于高活化构象，是STK38有效结合RIPK1并发挥功能的前提。

STK38 directly phosphorylates RIPK1 at serine 309（STK38直接磷酸化RIPK1 Ser³⁰⁹）

体外激酶实验显示重组活化STK38可直接磷酸化RIPK1（不依赖RIPK1自身激酶活性），底物区为中间结构域。候选位点丙氨酸扫描发现仅S309A丧失STK38介导磷酸化，且S309A不影响STK38结合。制备并验证pS309 RIPK1位点特异性抗体，TBZ刺激后内源性RIPK1于S309发生磷酸化，该信号依赖STK38与MEKK2。表明STK38直接磷酸化RIPK1中间结构域Ser³⁰⁹。

STK38-mediated phosphorylation of RIPK1 at serine 309 enhances RIPK1-dependent cell death by counteracting MK2-mediated inhibition（STK38介导的RIPK1 S309磷酸化通过拮抗MK2抑制增强RIPK1依赖细胞死亡）

RIPK1 KO细胞中回补S309A突变体较WT降低TBZ诱导坏死性凋亡、RIPK1(S166)/RIPK3/MLKL磷酸化及坏死体组装，凋亡亦受抑。AlphaFold预测S309磷酸化引起局部柔性环向α螺旋构象转变但不影响RIPK1整体折叠及自磷酸化能力。S309A细胞中邻近抑制位点Ser³²⁰磷酸化水平升高；MK2或TAK1抑制剂降低S320磷酸化并升高S166磷酸化，确认MK2为主要S320激酶。Co-IP显示STK38 WT（非K118R）削弱RIPK1–MK2结合，且S309A突变体较WT RIPK1更强结合MK2。STK38 KO或MEKK2 KO增强RIPK1–MK2相互作用。表明S309磷酸化诱导构象变化破坏MK2结合，解除S320抑制性磷酸化，促进RIPK1活化。RIPK1 S309仅高等灵长类（人/新世界猴）保守，小鼠对应位点为Pro，小鼠细胞STK38敲低不抑制坏死性凋亡，证实该调控具灵长类特异性。

STK38-activated RIPK1-dependent cell death correlates with improved survival in colorectal cancer（STK38激活的RIPK1依赖细胞死亡与结直肠癌较好生存相关）

TCGA READ数据分析显示低STK38或低RIPK1转录本关联差总生存期（OS）。268例CRC患者IHC示STK38与pRIPK1(S166)表达正相关（r=0.614, P<0.001）；STK38高/pRIPK1(S166)高患者OS显著优于低表达组，双高组5年OS率达93.7%。裸鼠HT-29异种移植模型中，STK38 KO瘤在TRAIL+Birinapant+Emricasan处理下较对照抵抗细胞死亡、生长更快；RIPK1 S309A回补或STK38敲低均削弱治疗响应，体内pS309 RIPK1减少、pS166 RIPK1与pMLKL降低、pS320 RIPK1升高。表明STK38–RIPK1(S309)轴具体内抑瘤功能并与CRC预后相关。

讨论部分总结（翻译研究结论）：

本研究鉴定STK38为通过磷酸化RIPK1 S309促进RIPK1活化、复合物组装及细胞死亡的新型激酶。机制上，TNF-α刺激下MEKK2激活STK38促进其招募至RIPK1，STK38高活化态是其结合RIPK1的前提；随后STK38磷酸化RIPK1 S309引发局部构象改变，破坏RIPK1与抑制性激酶MK2的相互作用，解除S320抑制性磷酸化并使S166自磷酸化得以进行——反之STK38缺失增强RIPK1–MK2结合、削弱RIPK1活性与细胞死亡。已知多数RIPK1磷酸化激酶为负调控因子，而本研究揭示STK38是首个经反式磷酸化直接激活RIPK1（除自磷酸化外）的激酶。RIPK1 S309为高等灵长类特有（啮齿类为Pro），该调控代表灵长类特异的对程序性细胞死亡微调机制，提示在将小鼠模型结论外推至人类疾病研究时需注意进化差异。临床上STK38表达与CRC中磷酸化RIPK1水平正相关，STK38缺陷或RIPK1 S309A使肿瘤抵抗坏死性凋亡并促进进展，提示STK38–RIPK1(S309)轴是CRC的抑癌机制及潜在治疗靶点，小分子STK38激动剂或可增强肿瘤坏死性凋亡并提高疗效。