MAD7介导的基因组编辑经由农杆菌（Agrobacterium）实现六倍体普通小麦（Triticum aestivum L.）T0代植株六同源基因拷贝均携带不同突变的六等位（hexa-allelic）编辑株系回收及编辑向后代稳定遗传

《In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant》：MAD7-mediated genome editing via Agrobacterium enables recovery of hexa-allelic edited lines carrying distinct mutations in all six gene copies in wheat (Triticum aestivum L.) T0 plants and stable inheritance of edits into the following generation

　　

扩展面包小麦（Triticum aestivum L.）基因组编辑工具对于加速性状改良及规避广泛使用的CRISPR系统相关知识产权限制至关重要。MAD7（ErCas12a），一种可免特许费获取的CRISPR核酸酶，是CRISPR-Cas9的潜在替代工具；然而其在复杂多倍体作物中的表现尚缺乏充分表征。本研究通过农杆菌（Agrobacterium）介导转化评估了MAD7在六倍体小麦中的体内（in planta）基因组编辑效率。研究人员靶向三个小麦亚基因组（A、B、D）中类胡萝卜素通量关键调控因子TaLCYε（LYCOPENE EPSILON CYCLASE，番茄红素ε-环化酶）基因的保守编码区。MAD7介导的编辑表现出对原型间隔相邻基序（PAM，protospacer adjacent motif）组成的强依赖性，仅在富T的PAM（TTTG）处检测到活性，导致26%的转基因T0植株出现靶标突变。值得注意的是，MAD7能够在T0世代即回收所有六个基因拷贝均携带不同突变的六等位（hexa-allelic）编辑株系，且编辑在T1代 progeny（子代）中稳定遗传，并有证据表明核酸酶活性可跨代持续。相比之下，在相同实验条件下CRISPR-Cas9对所测三种向导RNA（guide RNA，gRNA）中两种实现了更高编辑效率（最高达86%），并产生更广泛的突变谱，以小的插入缺失（indel，insertion/deletion）为主。MAD7诱导的编辑主要以中等长度缺失（6–15 bp）为特征，符合Cas12a型交错切割模式。本研究首次证明通过农杆菌介导转化可在六倍体小麦T0植株中回收MAD7编辑的六等位突变体，且编辑向T1代稳定遗传。

论文解读：MAD7介导的基因组编辑在六倍体小麦中实现TaLCYε基因六等位突变及跨代稳定遗传

研究背景与意义

面包小麦（Triticum aestivum L.，2n=6x=42，AABBDD）是全球重要粮食作物，但其基因组高度复杂（约15.5 Gbp），含六套同源基因拷贝（homoeolog），传统育种及基因功能研究需同时对六个拷贝进行敲除方能获得完全功能缺失表型。目前广泛应用的CRISPR-Cas9系统受专利限制，且PAM（protospacer adjacent motif，原型间隔相邻基序）要求严格（NGG），在某些靶区位点选择受限。MAD7（亦称ErCas12a，源自Eubacterium rectale）属II类V-A型CRISPR-Cas12a核酸酶，识别YTTN PAM（Y=T/C，N=A/T/C/G），仅需单链crRNA（CRISPR RNA），且有较宽松的知识产权许可框架，是具潜力的Cas9替代工具。此前MAD7在小麦中的评价多基于原生质体或基因枪法，农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导稳定转化下的编辑效率、PAM偏好及对六倍体基因组六等位编辑能力尚未明确。本研究以小麦类胡萝卜素途径关键基因TaLCYε（LYCOPENE EPSILON CYCLASE，催化番茄红素转向叶黄素合成分支）为靶标，评估MAD7在六倍体小麦中的编辑表现，并与CRISPR-Cas9比较，旨在拓展小麦基因组编辑工具箱并为类胡萝卜素代谢工程提供基础。

主要关键技术方法

研究人员选用六倍体普通小麦栽培种Fielder（含TaLCYε三个同源基因TraesFLD3A01G231600、TraesFLD3B01G283200、TraesFLD3D01G237800，各亚基因组单拷贝且约97%同源），针对其外显子保守区设计三条MAD7-crRNA（分别匹配CTTC、TTTG、CTTG PAM）及三条Cas9-gRNA。MAD7-crRNA克隆至pH-mono-MAD7载体（玉米Ubiquitin启动子驱动MAD7表达），Cas9-gRNA克隆至含GRF-GIF形态发生调节因子的JD633载体（玉米Ubiquitin启动子驱动Cas9）。农杆菌AGL1菌株侵染Fielder未成熟幼胚，共转化pANIC6A::GRF-GIF促再生，潮霉素筛选抗性愈伤并再生T₀植株。经PCR鉴定转基因阳性后，采用Illumina iSeq 100对靶区段进行扩增子二代测序（amplicon NGS），利用亚基因组间SNP区分A/B/D同源基因型，最小变异频率阈值2%，野生型对照排除背景错误，分析编辑效率与突变类型。T₀代六等位编辑株自交获T₁代并同样NGS检测编辑遗传情况。

研究结果

Next-generation sequencing and edits analysis

研究人员设计的三条MAD7-crRNA及三条Cas9-gRNA均靶向TaLCYε外显子2和3的A/B/D亚基因组保守区。转化2979枚幼胚（MAD7组）获351株再生苗，其中237株PCR筛查显示78株（33%）含pH-mono-MAD7转基因；MAD7-crRNA #1（PAM CTTC）、#2（PAM TTTG）、#3（PAM CTTG）阳性株数分别为6、42、30。Cas9组转化1289枚幼胚获38株再生，筛选排除双gRNA共整合后得35株单gRNA事件（gRNA #1：12株，#2：16株，#3：7株）。

Editing efficiency, mutation patterns of CRISPR-MAD7 system and propagation of the edits into following generation

NGS分析发现MAD7仅在crRNA #2（PAM TTTG）有编辑活性——42株阳性株中11株检出靶标突变，编辑效率26.2%；crRNA #1（CTTC）与#3（CTTG）均无编辑株。MAD7诱导缺失以中等长度为主：1–5 bp缺失占16.0±4.8%，6–10 bp缺失占54.8±8.2%，11–15 bp缺失占21.0±2.1%，另见单碱基替换9.1±7.5%。由于crRNA #2同时靶向三套亚基因组，T₀株出现从单亚基因组杂合（heterozygous，HT）到三亚基因组各呈双等位（biallelic）突变多种组合；其中三株（#4896、#4898、#4902）在所有六个等位基因（A、B、D亚基因组各两拷贝）均检出不同缺失（4–15 bp）导致的六等位（hexa-allelic）突变。此三株自交T₁代NGS证实编辑稳定遗传；一株T₁个体（4826–8）甚至较亲本T₀（4826，亚基因组A HT/B HM/D HT）呈现更彻底的全纯合（homozygous，HM）六等位编辑模式，提示MAD7核酸酶在T₁代仍有持续切割活性。

Comparison of gene editing activity between MAD7 and Cas9 nucleases in stable transgenic plants

在相同靶区比较下，Cas9-gRNA #1、#2、#3编辑效率分别为50%（6/12）、6%（1/16）、86%（6/7）。Cas9诱导突变谱更广，以小缺失（1–5 bp）为主，亦见大缺失及插入；MAD7则特征性产生6–15 bp中等缺失，符合Cas12a交错切割→非同源末端连接（NHEJ，non-homologous end joining）修复模式。Cas9同样可在T₀代获得TaLCYε六等位突变株（gRNA #1与#3），且编辑向T₁稳定遗传。

讨论与结论总结

本研究首次证实通过农杆菌介导转化，MAD7（ErCas12a）可在六倍体小麦T₀代直接获得六同源基因拷贝全部突变的hexa-allelic编辑株系，编辑向T₁代稳定遗传且可能伴跨代持续切割。MAD7编辑效率显著依赖PAM组成，仅在富T PAM（TTTG，符合YTTN共识）有活性，提示PAM选择对MAD7在小麦中应用至关重要。相较Cas9，MAD7整体编辑效率偏低（26% vs Cas9最高86%），突变谱较窄（典型6–15 bp缺失 vs Cas9多样indel），但二者均能实现六等位敲除。MAD7优势在于：①识别TTTN类PAM可补位Cas9（NGG）无法靶向区域；②较均一的缺失模式利于预测移码敲除；③免特许费或宽松授权利于公共部门及中小企业应用。局限含MAD7为水稻密码子优化（Cas9为小麦优化）及载体架构差异，严格定量比较需更多TTTG PAM靶点验证。综上，MAD7是小麦基因组编辑尤其是靶向富T区及需自由运营（freedom to operate）场景的有价值补充工具，本研究为小麦功能基因组学与代谢通路（如类胡萝卜素）工程拓展了CRISPR工具箱。