东亚兰花属Ephippianthus中分歧的菌根策略与营养模式

《Mycorrhiza》：Divergent mycorrhizal strategies and nutritional modes in the East Asian orchid genus Ephippianthus

　　

兰科（Orchidaceae）植物为研究异养（heterotrophy）的进化提供了理想体系，因为所有物种在萌发期间均依赖真菌碳源，而成体的营养模式则从自养（autotrophy）到完全菌根异养（full mycoheterotrophy）呈连续分布。亚族Calypsoinae通过真菌伙伴和营养策略的反复转变展示了这种多样性。近期系统基因组学分析将Dactylostalix–Ephippianthus支系定位为包含多个异养谱系的Corallorhiza支系的姐妹群，这引发了对Ephippianthus成体营养方式的研究问题。本研究结合真菌代谢条形码（fungal metabarcoding）与δ¹³C和δ¹⁵N分析，研究了仅分布于日本及周边俄罗斯远东地区的两个已知Ephippianthus物种的生理生态学。研究发现，Ephippianthus schmidtii主要与Tulasnellaceae（Cantharellales目）相关联，其δ¹³C和δ¹⁵N值相对于共存自养植物未呈现显著正富集，基于这些同位素标记无证据表明其获得大量真菌营养。相反，Ephippianthus sawadanus主要与腐生性Cyphellaceae（Agaricales目）相关联，这是研究人员所知的首次在绿色兰花中检测到该科植物作为优势菌根伙伴的文献记录。此外，E. sawadanus相对于自养植物表现出升高的δ¹³C和δ¹⁵N值，与其碳氮预算中获得大量真菌贡献相一致。综上，这些发现揭示了东亚兰花属Ephippianthus中分歧的菌根策略和营养模式。

兰科（Orchidaceae）是单子叶植物中最大的科之一，为研究菌根异养（mycoheterotrophy）的进化提供了理想模型体系。兰花种子缺乏胚乳，必须在菌根真菌定殖后才能萌发，真菌为其提供碳源和矿质营养。尽管许多兰花之后发育出光合作用叶片并以自养为主，但部分种类在成体阶段仍保留对真菌碳的部分依赖，更有超过250个物种在整个生活史中均为完全菌根异养。

绿色兰花通常与根瘤菌（rhizoctonia）真菌相关联，这是一类在系统发育上多源的腐生或内生担子菌，隶属于Ceratobasidiaceae、Tulasnellaceae和Serendipitaceae等科。相比之下，对真菌依赖较强的兰花则常与外生菌根真菌（ectomycorrhizal fungi）如Sebacinaceae、Thelephoraceae和Russulaceae等科的真菌相关联，或与腐生非根瘤菌真菌如Mycenaceae和Psathyrellaceae等科的真菌相关联。稳定同位素分析是检测真菌营养获取的有用工具，因为菌根异养植物通常相对于自养参照植物具有升高的δ¹³C、δ¹⁵N和δ²H值。然而，δ¹³C在根瘤菌关联的兰花中诊断性可能较弱，这些兰花即使获取真菌碳源也可能表现出很小或没有¹³C富集。

亚族Calypsoinae隶属于树兰亚科（Epidendroideae），包含约80个物种，分属13个属，在营养体形态、真菌关联和营养策略方面表现出显著多样性。近期系统基因组学分析修订了Calypsoinae的进化框架，将Dactylostalix–Ephippianthus支系定位为Corallorhiza支系的姐妹群，后者包括Aplectrum、Cremastra、Govenia、Oreorchis、Kitigorchis和Corallorhiza等属。这一系统位置对于理解菌根异养的进化具有重要意义。Corallorhiza支系的多个成员表现出强烈的部分或完全菌根异养，并与外生菌根真菌或腐生非根瘤菌真菌相关联。然而，Ephippianthus的真菌伙伴和成体营养模式此前尚未被研究。

本研究旨在确定两个已知Ephippianthus物种是否与根瘤菌真菌或其他真菌谱系相关联，通过真菌代谢条形码分析菌根根状茎并结合叶片δ¹³C和δ¹⁵N分析与共存自养参照植物的比较，探究这两个物种是否在优势真菌伙伴上存在差异，以及其同位素值是否指示部分菌根异养。

**样本来源与采样方案**

稳定同位素分析和菌根伙伴分子鉴定的野外调查在每个物种的一个地点进行。Ephippianthus sawadanus的种群于2020年7月29日在日本静冈县须惠野市须山进行调查，该地点为凉爽温带山地森林，优势树种包括锐齿栎（uji、日本马醉木、陇月杜鹃等。Ephippianthus schmidtii的采样于2021年6月15日在日本静冈县富士宫市粟仓进行，该地点为亚高山针阔混交林，优势树种包括日本铁杉、本州云杉、日本桤木等。

**分子鉴定菌根真菌**

研究人员从根状茎中成功获取菌根片段：E. sawadanus共3个个体，E. schmidtii共7个个体。经表面消毒后采用CTAB法提取DNA，使用两套引物对真菌ITS2（Internal Transcribed Spacer 2, 内转录间隔区2）区域进行扩增：ITS86F/ITS4引物对用于宽泛的兰花菌根群落，以及一套新设计的针对Tulasnella属的特异性引物对5.8S-Tulngs-7/ITS4-Tul2。扩增子文库使用Element AVITI系统或Illumina MiSeq系统进行测序，生物信息学分析采用Claident软件进行，OTUs（Operational Taxonomic Units, operational分类单元）按97%序列相似性聚类。

**δ¹³C和δ¹⁵N分析**

使用连接Flash EA 2000元素分析仪的Delta XP质谱仪测定E. sawadanus、E. schmidtii及邻近自养参照植物中¹³C和¹⁵N的自然丰度。同位素比值以相对于Vienna Pee Dee Belemnite（碳）或大气N₂（氮）的δ值表示。富集因子（ε¹³C和ε¹⁵N）计算为每个Ephippianthus标本与同一样地自养参照植物均值δ值的差值。使用线性混合模型检验差异，植物类别为固定效应，样方为随机效应。

**菌根真菌分子鉴定结果**

在稀疏化数据集中，从3个成功分析的E. sawadanus个体中恢复出2个OTU和16,791条序列。该群落由单个Cyphellaceae OTU主导，出现于所有3个个体中，占16,471条序列（98.09%）。系统发育分析将该OTU与腐生菌Hemimycena mairei和H. gracilis置于同一分支。鉴于该属的系统关系尚未完全解决，研究人员将其保守地鉴定为Cyphellaceae sp.。第二个OTU归属于Tulasnellaceae，仅在一个个体中发现，占320条序列（1.91%）。

相比之下，E. schmidtii在所有7个成功分析的个体中均由根瘤菌真菌主导。5个Tulasnellaceae OTU占33,827条序列（86.34%），1个Rhizoctonia（Ceratobasidiaceae）OTU占641条序列（1.64%）。Tulasnellaceae OTU出现于所有7个个体中，其中Tulasnellaceae OTU1在5个个体中检测到，贡献23,003条序列（58.71%）。系统发育重建显示，与E. schmidtii关联的优势Tulasnellaceae OTU与其他根瘤菌关联兰花的已知菌根伙伴聚类。

E. schmidtii中还检测到若干次要OTU，包括未分类的Agaricales OTU1（2个个体，2,636条序列；6.73%）、Hyaloscypha OTU1（2个个体，1,031条序列；2.63%）、Hyaloscypha OTU2（2个个体，151条序列；0.39%）、Hyaloscypha OTU3（2个个体，39条序列；0.10%）、Russula OTU1（627条序列；1.60%）、Russula OTU2（60条序列；0.15%）、Mycena OTU1（128条序列；0.33%）和Auriculariales OTU1（39条序列；0.10%）。由于这些非根瘤菌OTU相对丰度较低，被视为群落的次要组成部分。

**δ¹³C和δ¹⁵N分析结果**

Ephippianthus sawadanus相对于共存自养植物表现出显著的¹³C和¹⁵N富集。E. sawadanus的δ¹³C值（?29.9 ± 1.6‰，n=4）显著高于邻近自养植物（?33.7 ± 0.7‰，n=12；P < 0.001）。同样，E. sawadanus的δ¹⁵N值（?1.5 ± 0.9‰，n=4）显著高于自养参照植物（?6.2 ± 0.7‰，n=12；P < 0.001）。富集因子ε¹³C和ε¹⁵N分别为3.8 ± 1.5‰和4.6 ± 1.0‰。

相反，E. schmidtii相对于周围自养植被未表现出¹³C或¹⁵N的正富集。E. schmidtii的δ¹³C值（?35.1 ± 1.1‰，n=4）略低于但显著不同于同地点自养植物（?33.7 ± 0.6‰，n=14；P=0.006）。E. schmidtii的δ¹⁵N值（?5.5 ± 0.2‰，n=4）与自养植物（?6.3 ± 1.8‰，n=14；P=0.418）无显著差异。富集因子ε¹³C和ε¹⁵N分别为?1.4 ± 1.4‰和0.7 ± 0.3‰。

**讨论**

代谢条形码分析揭示了两个Ephippianthus物种菌根群落的显著差异。E. schmidtii的根状茎主要由根瘤菌真菌定殖，这是光合兰花的典型共生伙伴。相反，E. sawadanus主要与Cyphellaceae（Agaricales目）相关联，这是一个典型的腐生谱系，包含栖息于腐朽木材和落叶层中的真菌。据研究人员所知，这是在绿色兰花中首次记录到该科植物作为优势菌根伙伴的文献报道。

稳定同位素数据支持两个物种之间对比鲜明的营养策略。Ephippianthus schmidtii在δ¹⁵N值上与自养植物无显著差异，且其δ¹³C值略低但显著不同。这些结果未提供δ¹³C和δ¹⁵N分析可检测的真菌碳或氮获取证据，尽管隐匿性部分菌根异养仍有可能存在，需通过δ²H分析加以验证。E. schmidtii偶尔与Russula和Mycena等真菌相关联，这些属包括已知的高度菌根异养兰花的菌根伙伴。鉴于其低序列丰度和缺乏¹³C或¹⁵N富集，这些真菌可能对E. schmidtii的成体碳预算贡献甚微。然而，这种兼性关联可能为向增强异养的转变提供生态机会，与"等候室假说"（waiting room hypothesis）一致。

相反，E. sawadanus相对于自养参照植物表现出显著的¹³C和¹⁵N富集。其¹³C富集（3.8 ± 1.5‰）与部分菌根异养兰花的平均富集报道值（3.2‰；n=189）相似，表明真菌对其碳预算有实质性贡献。其¹⁵N富集（4.6 ± 1.0‰）也与部分菌根异养Calypsoinae物种与腐生Psathyrellaceae关联时的报道值（约4‰）相似。然而，E. sawadanus的¹⁵N富集低于与外生菌根真菌关联兰花的平均值（9.6‰），这很可能反映了腐生真菌相对于外生菌根真菌通常较低的¹⁵N富集。

在完全菌根异养兰花的进化过程中，腐生真菌的招募已反复发生，来自Cremastra appendiculata物种复合体的证据表明这种关联可能先于光合作用的丧失。E. sawadanus与Cyphellaceae的关联进一步证明，腐生真菌进入兰花菌根伙伴关系的招募可能促进真菌依赖性的增强。有趣的是，Cyphellaceae真菌Mycopan scabripes也曾被报道作为完全菌根异养兰花Gastrodia flavilabella的共生伙伴，表明Cyphellaceae真菌能够支持具有大量真菌碳获取的兰花。

在Corallorhiza支系内，增强的异养性已反复与Kitigorchis和Corallorhiza中外生菌根真菌的转变或Oreorchis和Cremastra中腐生真菌的转变相一致。E. sawadanus的腐生伞菌伙伴和强烈同位素富集，连同E. schmidtii和Dactylostalix很大程度上自养的状态，表明在Dactylostalix–Ephippianthus谱系中强部分菌根异养的独立起源。与许多高度异养的Calypsoinae物种不同，E. sawadanus缺乏珊瑚状根状茎，表明这种结构对于大量真菌碳获取并非必需。

**结论**

本研究揭示了两种已知Ephippianthus物种之间菌根关联和营养策略的显著差异。Ephippianthus schmidtii主要与根瘤菌真菌相关联，相对于自养参照植物未表现出可检测的¹³C或¹⁵N富集。相反，E. sawadanus主要与腐生Cyphellaceae相关联，并显示出与部分菌根异养一致的强¹³C和¹⁵N富集。这些同一属内的对比策略凸显了兰花–真菌互作的进化灵活性，并表明腐生真菌伙伴的招募可以促进真菌依赖性的增强。然而，由于每个物种均采自单一群体，需要更广泛的调查来确定这些真菌关联和同位素特征是否在地理上稳定。