《Stress Biology》：Effector FpECIR from Fusarium pseudograminearum targets wheat ethylene signaling pathway to suppress plant immunity
编辑推荐：
假禾谷镰孢（Fusarium pseudograminearum，F. pseudograminearum）是小麦冠腐病（Fusarium Crown Rot，FCR）的主要病原菌，对小麦产量构成严重威胁。效应蛋白作为植物病原菌的一类"武器"，通过干扰植物免疫
假禾谷镰孢（Fusarium pseudograminearum，F. pseudograminearum）是小麦冠腐病（Fusarium Crown Rot，FCR）的主要病原菌，对小麦产量构成严重威胁。效应蛋白作为植物病原菌的一类"武器"，通过干扰植物免疫反应协助病原菌侵染寄主。本研究中，研究人员鉴定了一个分泌型效应蛋白FpECIR（F. pseudograminearum Effector Containing two Internal Repeats），该蛋白无任何已知功能结构域，能够抑制本氏烟草（Nicotiana benthamiana）中INF1（一种激发子蛋白）诱导的细胞死亡。FpECIR（不含信号肽）转运进入小麦细胞后，与小麦转录因子TaPLATZ2B（Plant AT-rich sequence- and zinc-binding protein）发生相互作用；沉默TaPLATZ2B及其等位基因使小麦对F. pseudograminearum更加感病。缺失FpECIR第29-35位氨基酸残基破坏了其与TaPLATZ2B的相互作用，并使其丧失抑制INF1诱导细胞死亡的能力。缺失突变体ΔFpecir对小麦胚芽鞘的致病力显著降低。转录组数据分析显示，ΔFpecir菌株侵染诱导了小麦胚芽鞘中防御相关基因的上调表达，其中多数基因功能富集于激素信号通路。qRT-PCR结果表明，FpECIR抑制了TaPLATZ2B及乙烯信号通路相关基因的表达。此外，EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay，凝胶迁移阻滞实验）结果证明，FpECIR能够抑制TaPLATZ2B与乙烯响应因子（Ethylene Response Factor，TaERF020L）启动子区域的结合能力。抑制乙烯生物合成相关基因的转录水平使小麦对FCR更加感病。总体而言，结果表明FpECIR在F. pseudograminearum的致病性中发挥重要作用，且FpECIR的结构完整性对其与TaPLATZ2B的相互作用及抑制INF1诱导细胞死亡的能力是必需的。此外，FpECIR不仅影响TaPLATZ2B的表达，还通过乙烯信号通路抑制TaPLATZ2B调控植物防御反应的功能。
小麦作为全球主要粮食作物之一，是膳食能量和蛋白质的主要来源，为全球人口提供约40%的总热量和蛋白质摄入。中国作为小麦生产大国，约占全球小麦产量的17%。然而，由土壤传播病原真菌假禾谷镰孢（Fusarium pseudograminearum）引起的小麦冠腐病（Fusarium Crown Rot，FCR）自2011年在中国河南省首次发现以来，已在全球范围内造成严重的产量损失。该病原菌在侵染过程中产生的脱氧雪腐镰刀菌醇（Deoxynivalenol，DON）等霉菌毒素可污染谷物及其制品，严重危害人畜健康。2013至2016年的调查显示，FCR已广泛.minor遍布黄淮麦区这一中国最重要的小麦产区。尽管已鉴定出若干FCR抗性基因，但有效抗性资源仍然有限。
在病原菌与寄主的互作过程中，效应蛋白作为病原菌分泌的小分子蛋白，通过干扰植物免疫系统促进侵染。假禾谷镰孢在侵染阶段可产生多种产物，包括次级代谢物、毒素、效应蛋白和酶类。然而，大多数效应蛋白的功能及其作用靶标尚不清楚。转录因子（Transcription Factors，TFs）是参与植物多种信号转导途径的关键调控因子，通过激活或抑制下游靶基因的表达发挥作用。PLATZ（Plant AT-rich sequence- and zinc-binding）蛋白是一类新型转录因子，首次在豌豆中被鉴定，能够结合A/T富集DNA序列。PLATZ蛋白广泛参与植物生长发育和逆境响应，在不同物种中展现出保守性和物种特异性功能。小麦基因组复杂，已鉴定出62个TaPLATZ基因并分为六个系统发育群。研究表明，TaPLATZ5通过与组蛋白乙酰转移酶TaHAG1互作激活TaPAD4表达，赋予小麦对白粉病的抗性。然而，关于效应蛋白对PLATZ转录因子功能的影响迄今未见报道。
基于此背景，研究人员开展了对效应蛋白FpECIR的系统研究，该成果发表于《Stress Biology》期刊。
研究人员采用的主要关键技术方法包括：生物信息学分析（SignalP-6.0、TMHMM-2.0、SMART、AlphaFold v3预测蛋白结构与互作）、YTK12酵母分泌系统验证信号肽功能、农杆菌介导的瞬时表达系统、酵母双杂交（Y2H）文库筛选、GST pull-down与Co-IP验证蛋白互作、BSMV-VIGS病毒诱导基因沉默技术、RNA-Seq转录组测序、qRT-PCR定量分析以及EMSA凝胶迁移阻滞实验。其中，Y2H筛选所用cDNA文库来源于F. pseudograminearum侵染的小麦胚芽鞘RNA；BSMV-VIGS所用小麦材料为AK58品种。
**FpECIR作为胞质效应蛋白的功能特性**
研究人员首先分析了FpECIR的基本特征。该蛋白由150个氨基酸组成，编码基因开放阅读框（ORF）为453 bp，预测含有17个氨基酸的信号肽，无跨膜螺旋和已知保守功能结构域，但含有两个内部重复序列IR1和IR2。通过YTK12酵母分泌系统验证其信号肽具有分泌功能。qRT-PCR检测显示，FpECIR在侵染过程中表达量上调超过10倍。为验证其亚细胞定位，研究人员构建了FpECIR-mCherry-3×NLS融合表达载体并转化野生型菌株WZ-8A，在小麦胚芽鞘侵染位点观察到红色荧光信号定位于细胞核中，证实FpECIR可被转运进入小麦细胞并作为胞质效应蛋白发挥功能。
**FpECIR抑制INF1诱导的细胞死亡**
为探究FpECIR在调控植物免疫中的作用，研究人员在本氏烟草中瞬时表达FpECIR
SP（全长）和FpECIR（不含信号肽）。农杆菌介导的瞬时表达实验表明，两种形式均不能诱导细胞死亡，但均可抑制INF1诱导的细胞死亡，说明信号肽对FpECIR的功能并非必需。亚细胞定位分析显示FpECIR-GFP融合蛋白定位于细胞核和细胞质。进一步构建含核输出信号（NES）的突变体FpECIR-NES-GFP，发现其丧失抑制INF1诱导细胞死亡的能力，表明核定位对FpECIR的功能至关重要。
**序列完整性对FpECIR功能的必要性**
系统发育分析显示FpECIR同源基因分布于植物病原菌、动物病原菌、生防真菌及其他真菌中。AlphaFold v3预测结构表明FpECIR的N端区域（18-67 aa）和C端区域（68-150 aa）具有相似的三维结构，各含一个内部重复序列。功能分析发现，单独表达N端（FpECIR
N）或C端（FpECIR
C）均不能抑制INF1诱导的细胞死亡，说明全长序列的完整性对FpECIR的功能是必需的。
**FpECIR与转录因子TaPLATZ2B的相互作用**
通过Y2H文库筛选，研究人员鉴定出14个候选互作蛋白，其中3个克隆为 wheat AT-rich zinc-binding蛋白，由TraesCS2B02G469000编码，其等位基因报道为TaPLATZ5，于是将该蛋白命名为TaPLATZ2B。Y2H、GST pull-down、Co-IP及共定位实验均证实FpECIR与TaPLATZ2B存在相互作用，且两者在细胞核中共定位。
**关键互作位点的鉴定**
基于AlphaFold v3预测的结构模型，FpECIR第29-35位残基与TaPLATZ2B的多个残基形成氢键：Glu29与Ser92、Asp30与Ser93、Cys33与Tyr115和Ile116、Ala35与Thr114。缺失突变体FpECIR
Δ29-35的Y2H、GST pull-down和Co-IP实验均显示其丧失与TaPLATZ2B的互作能力，且不能抑制INF1诱导的细胞死亡。将TaPLATZ2B的92S93S突变为92A93A的突变体TaPLATZ2B
M1丧失与FpECIR的互作，而114-116TYI突变为114-116AAA的突变体TaPLATZ2B
M2仍保留互作能力，支持了预测互作位点的可靠性。
**TaPLATZ2B正向调控小麦对FCR的抗性**
通过BSMV介导的VIGS技术同时沉默TaPLATZ2B及其两个等位基因，qRT-PCR显示沉默效率达30%-60%。接菌实验表明，TaPLATZs沉默植株表现出更严重的症状和更长的病斑，且植株生长瘦弱，说明TaPLATZ2B不仅参与小麦发育调控，还正向调控小麦对F. pseudograminearum的抗性。
**FpECIR对F. pseudograminearum致病力的贡献**
通过分裂标记法获得FpECIR基因缺失突变体ΔFpecir，其生长速率慢于野生型（WT）和回补菌株cFpecir，但不影响产孢量。小麦胚芽鞘侵染实验显示，ΔFpecir致病力显著降低，证明FpECIR对F. pseudograminearum的完全致病力是必需的。
**ΔFpecir对小麦转录水平的影响**
RNA-Seq分析显示，与WT相比，ΔFpecir侵染导致小麦胚芽鞘中2,539个基因上调、1,276个基因下调。GO富集分析表明防御反应相关基因显著富集；KEGG通路分析揭示激素信号通路参与其中。qRT-PCR验证显示，ΔFpecir侵染的胚芽鞘中TaPLATZ2B及乙烯信号通路相关基因TaERF1、TaPR3、TaWRKY53表达上调，而水杨酸（Salicylic Acid，SA）通路基因TaPR1和茉莉酸（Jasmonic Acid，JA）通路基因TaPR6也上调表达。
**FpECIR抑制TaPLATZ2B的DNA结合活性**
根据RNA-Seq数据选取表达上调的乙烯响应因子TaERF020L，设计其启动子区42 bp的biotin标记探针进行EMSA实验。结果显示TaPLATZ2B可直接结合该探针，但加入FpECIR后结合能力显著下降，证明FpECIR通过抑制TaPLATZ2B与乙烯信号通路基因启动子的结合来影响其功能。
**乙烯信号通路正向调控小麦对F. pseudograminearum的抗性**
利用乙烯生物合成抑制剂AVG处理小麦后接菌，结果显示AVG处理植株病斑更长、症状更重，且TaPR3、TaERF1和TaWRKY53表达显著降低，证实乙烯信号在小麦抗F. pseudograminearum感染中的重要作用。
**讨论与结论总结**
在讨论部分，研究人员指出PAMP触发免疫（PAMP Triggered Immunity，PTI）和效应蛋白触发免疫（Effector Triggered Immunity，ETI）构成植物免疫系统的两大分支。FpECIR作为无任何已知功能结构域的"孤儿蛋白"，通过抑制INF1诱导的细胞死亡发挥毒性效应，这与已报道的Osp24等孤儿蛋白功能类似。FpECIR与TaPLATZ2B的相互作用及其对乙烯信号通路的调控，揭示了病原菌效应蛋白操纵寄主免疫的新机制。
PLATZ转录因子在不同植物中的功能具有保守性，参与生长发育和多种逆境响应。本研究中TaPLATZ2B沉默导致小麦发育迟缓且更加感病，与玉米、水稻等物种中PLATZ基因的功能一致。乙烯信号通路通过激活防御基因表达和ROS产生参与植物抗逆响应，FPpECIR通过抑制TaPLATZ2B功能从而下调乙烯通路基因表达，削弱小麦防御反应。
结构预测与功能验证相结合，明确了FpECIR第29-35位残基为关键互作位点，N端内部重复序列的保守性及其结构完整性对功能至关重要。
研究结论如下：FpECIR作为假禾谷镰孢的胞质效应蛋白，能够抑制INF1诱导的细胞死亡；多种独立实验证实FpECIR与TaPLATZ2B物理互作；FpECIR通过抑制TaPLATZ2B表达并降低其与激素信号通路相关基因启动子区域的结合能力，从而下调这些基因的表达，贡献于F. pseudograminearum的致病力；N端内部重复序列高度保守且序列完整性对FpECIR的功能是必需的。值得注意的是，TaPLATZ2B作为小麦抗F. pseudograminearum的正调控因子，是被该效应蛋白操纵的重要寄主靶标。这些发现为理解病原菌致病机制和培育抗病小麦品种提供了新的理论依据和靶标基因。
